红景天提取物对胰岛素抵抗大鼠肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体-γ mRNA表达的影响

王峥嵘 张鸿雁 凌 鑫 宋光耀 刘 淼 马艳艳

(河北省中医院肿瘤二科，河北 石家庄 050011)

红景天提取物对胰岛素抵抗大鼠肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体-γ mRNA表达的影响

王峥嵘 张鸿雁1凌 鑫2宋光耀3刘 淼4马艳艳5

(河北省中医院肿瘤二科，河北 石家庄 050011)

目的观察中药红景天提取物对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性及过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)mRNA表达的影响。方法将70只Wistar大鼠随机分为2组，正常对照组20只，高脂模型组50只。正常对照组给予基础饲料，高脂模型组给予高脂饲料，均喂养4周后2组各随机选取10只大鼠行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验判断造模是否成功，确认造模成功后将剩余高脂模型组大鼠随机分为高脂对照组和高脂+红景天干预组，每组20只。高脂+红景天干预组给予红景天提取物1g/(kg·d)灌胃，正常对照组及高脂对照组给予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，其他饲养条件不变，继续喂养4周。观察比较各组大鼠造模后和灌胃4周后血清甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、空腹血糖(FPG)及空腹血清胰岛素(FINS)的含量变化，并记录葡萄糖输注率(GIR)变化及PPAR-γ mRNA的表达情况。结果高脂模型组大鼠造模后与正常对照组比较FPG、FINS明显升高(P<0.05)，GIR明显下降(P<0.05)；高脂对照组灌胃4周后与正常对照组比较TG、TC及FFA水平均明显升高(P<0.05)，高脂+红景天干预组较高脂对照组TC、TG及FFA水平均明显下降(P<0.05)，与正常对照组水平相当(P>0.05)；高脂对照组灌胃4周后与正常对照组比较FPG、FINS明显升高(P<0.05)，GIR明显下降(P<0.05)，高脂+红景天干预组较高脂对照组FPG、FINS水平明显下降(P<0.05)，GIR明显升高(P<0.05)，与正常对照组水平相当相(P>0.05)；高脂对照组灌胃4周后PPAR-γ mRNA表达水平与正常对照组表达水平相当(P>0.05)，高脂+红景天干预组较正常对照组及高脂对照组比较PPAR-γ mRNA表达水平均有明显升高(P<0.05)。结论红景天提取物对大鼠的胰岛素抵抗有显著地改善作用，降低血清TG、TC及FFA明显降低，调节FPG平衡，降低FINS水平，增加GIR，提高胰岛素敏感性，提示其作用机制可能与提高胰岛素抵抗大鼠肝脏细胞PPAR-γ mRNA表达有关。

胰岛素抗药性；红景天；过氧化物酶体增殖物激活受体；大鼠：动物，实验；RNA

随着人们物质生活水平提高，日常膳食中高脂肪等高热量食物摄入增加，使高脂血症、冠心病、脂肪肝、2型糖尿病的发病率日益增长，大量研究发现，胰岛素抵抗是这些疾病的共同发病基础。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)是调节胰岛素敏感性的一个重要因子，大量的实验研究证实PPARs具有多种生物学功能，如增强机体对胰岛素敏感性、调解体内糖平衡，尤其是在脂肪分化与脂质代谢调控等方面起到重要作用，和高脂血症密切相关[1]。红景天提取物是中药红景天根部的提取物，气香甜、味苦涩，主要成分为红景天苷和红景天苷元，具有增强免疫功能、保护心脑血管等功效。本实验研究拟通过观察红景天提取物对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗模型大鼠肝脏细胞PPAR-γ mRNA表达的影响，进一步探讨其改善胰岛素抵抗的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠70只，月龄16～20周，体质量250～300g，均购自河北医科大学实验动物中心，动物许可证号：604095。

1.1.2 药品与试剂 红景天提取物，诺迪康胶囊(主要成分为圣地红景天，西藏诺迪康药业股份有限公司，国药准字Z10980020，批号050410)；基础饲料及高脂饲料，河北医科大学实验动物中心；胰岛素放射免疫分析药盒、RNA提取试剂Trizol Reagant，美国Invitrogen公司；定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒，中山医科大学达安基因股份有限公司；溴化乙啶(EB)、电泳buffer液、硼酸、Tris、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)，华美生物工程公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇等RNA提取试剂均为分析纯，天津市泰兴试剂厂。

1.1.3 仪器 Advantage血糖仪，美国罗氏公司；Beckman X20全自动生化分析仪，美国贝克曼库尔特有限公司；实时荧光定量PCR仪(ABI 7300)，美国ABI公司；PCR仪(PE9600)，美国Perkin Elmer公司；紫外分光光度计(756MC)，上海精密仪器科学有限公司；台式离心机(LDZ5-2型)，北京医用离心机厂；低温离心机(EBA12R)，德国Hettich公司；电动超细匀浆器(F6/10)，上海弗鲁克流体机械制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 全部70只大鼠给予常规适应性喂养1周，然后随机分为2组，正常对照组20只，高脂模型组50只。正常对照组给予基础饲料，热量组成：碳水化合物占65.5%，脂肪占10.3%，蛋白质占24.2%；高脂模型组给予高脂饲料，热量组成：碳水化合物占20.1%，脂肪占59.8%，蛋白质占20.1%。2组大鼠喂养4周后，各组随机选10只大鼠，禁食12h，行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验[2]，判断造模是否成功。确认造模成功后将剩余高脂模型组大鼠随机分为高脂对照组和高脂+红景天干预组，每组20只。高脂+红景天干预组给予红景天提取物1g/(kg·d)灌胃，正常对照组及高脂对照组给予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，其他饲养条件不变，继续喂养4周。

1.2.2 高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验[2]

1.2.2.1 插管 高脂饮食喂养4周后正常对照组和高脂模型组组各随机取10只大鼠，禁食水12h后，以戊巴比妥钠60mg/kg腹腔内麻醉，在麻醉状态下分离皮下组织和肌肉，分离单侧的颈静脉和颈动脉，进行单侧颈静脉和颈动脉插管，插管后保留4～5cm导管经皮下从颈后引出，用100U/mL肝素溶液1mL及粘堵剂封管，用缝线及胶布固定在颈后皮肤上。对颈部伤口喷洒抗生素(如庆大霉素)，并依次缝合肌肉、皮下组织及皮肤，待大鼠清醒后单笼饲养，继续给予基础或高脂饲料喂养。

1.2.2.2 高胰岛素-正葡萄糖钳夹术 插管3d后，禁食水12h，在清醒状态下行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验。颈静脉导管通过三通接头连接双通道微量输液泵，一端接胰岛素输液泵(浓度为40mU/mL胰岛素)，另一端接葡萄糖输液泵(浓度为30%的葡萄糖)，颈动脉导管远端连接装有50U/mL肝素溶液的注射器，避免在取血样时发生凝血。待大鼠平静20～30min后，自颈动脉导管取血1mL，测定基础血糖和胰岛素。待基础血糖稳定后，在大鼠清醒状态下开始持续输注胰岛素，速度为4mU/(kg·min)，并同时按5mg/(kg·min)的速率输注葡萄糖。每10min颈动脉取血测定血糖，根据血糖值调整葡萄糖输注速度，使大鼠血糖保持在实验前空腹血糖(FPG)±0.5mmol/L的范围内，当连续5次血糖都在上述范围时即为稳态形成，记录稳态下5～6次葡萄糖输注速率(GIR)的平均值作为大鼠胰岛素敏感性的评价指标。

1.3 观察指标及方法 各组大鼠于造模后和灌胃4周时禁食12h后心脏采血检测血清甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、FPG及空腹血清胰岛素(FINS)的含量变化，并记录GIR变化及PPAR-γ mRNA的表达情况。TC、TG采用Beckman X20全自动生化分析仪测定；FFA采用铜显色法测定；FINS采用胰岛素放射免疫分析药盒测定；FPG采用罗氏Advantage血糖仪；PPAR-γ mRNA表达采用荧光定量PCR技术检测。称取80mg肝脏组织，剪碎，加入Trizol液1mL，充分匀浆，按照Trizol试剂说明书提取总RNA，取总RNA 400ng采用逆转录试剂盒将总RNA转录为cDNA。PPAR-γ上游引物为5'-TGGAGTCCACGCATGTGAAG-3'，下游引物为5'-CGCCAGCTTTAGCCGAATAG-3'，扩增片段64bp，反应条件：93℃ 3min，然后93℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行40个循环。采用PE9600荧光定量PCR仪进行模板cDNA含量的测定。取值目的基因PPAR-γ mRNA的起始拷贝数与内参基因GAPDH mRNA起始拷贝数的比值进行分析。

2 结 果

2.1 正常对照组与高脂模型组造模后FPG、FINS及GIR水平比较 见表1。

nFPG(mmol/L)FINS(mmol/L)[GIRmg/(kg·min)]正常对照组204．78±0．1411．76±3．0629．36±7．07高脂模型组505．34±0．11∗13．97±0．44∗20．99±4．30∗

与正常对照组比较，*P<0.05

由表1可见，高脂模型组造模后FPG、FINS及GIR水平与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，FPG、FINS明显升高，GIR明显下降。

2.2 各组灌胃4周后TG、TC及FFA水平比较 见表2。

nTGTCFFA正常对照组100．59±0．090．81±0．09676．3±138．5高脂对照组200．74±0．04∗1．01±0．01∗1252．4±432．6∗高脂+红景天干预组200．58±0．11△0．78±0．14△680．3±164．9△

与正常对照组比较，*P<0.05；与高脂对照组比较，△P<0.05

由表2可见，高脂对照组灌胃4周后TG、TC及FFA水平与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，均明显升高；高脂+红景天干预组灌胃4周后TC、TG及FFA水平与高脂对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，TC、TG及FFA水平较高脂对照组均明显下降，与正常对照组水平相当。

2.3 各组灌胃4周后FPG、FINS及GIR水平比较 见表3。

nFPG(mmol/L)FINS(mmol/L)[GIRmg/(kg·min)]正常对照组104．86±0．1412．36±3．0630．36±7．07高脂对照组205．52±0．11∗19．97±7．44∗19．99±4．3∗高脂+红景天干预组204．92±0．11△12．74±0．14△24．6±5．47△

与正常对照组比较，*P<0.05；与高脂对照组比较，△P<0.05

由表3可见，高脂对照组灌胃4周后FPG、FINS及GIR与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，FPG、FINS升高，GIR降低；高脂+红景天干预组灌胃4周后FPG、FINS及GIR与高脂对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，FPG、FINS水平较高脂对照组均明显下降，GIR升高，与正常对照组水平相当相比。

2.4 各组灌胃4周后PPAR-γ mRNA表达水平比较 见表4。

正常对照组(n=10)高脂对照组(n=20)高脂+红景天干预组(n=20)PPAR-γmRNA0．3674±0．12090．3916±0．12484．450±1．6464∗△

与正常对照组比较，*P<0.05；与高脂对照组比较，△P<0.05

由表4可见，高脂对照组灌胃4周后PPAR-γ mRNA表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，表达水平相当；高脂+红景天干预组灌胃4周后PPAR-γ mRNA表达水平与正常对照组及高脂对照组比较差异均有统计学意义，均有明显升高。

3 讨 论

胰岛素抵抗是多种疾病共同发病基础，如2型糖尿病、肥胖、高脂血症、冠心病等。过氧化物酶体是具有多种功能的细胞器，如参与脂肪酸的氧化等，过氧化物酶体功能缺陷可以引起多种疾病。过氧化物酶体能在许多结构不同的化学物质作用下增生，这些物质被称为过氧化物酶体增殖剂。PPAR有3种亚型，即PPAR-α、PPAR-γ、PPAR-β，其中PPAR-α和PPAR-γ分别对调控肝细胞和脂肪细胞的代谢功能发挥重要作用。许多饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸都是PPAR的配体，PPAR经由这些生理浓度的天然配体活化后，能够调控脂肪酸的过氧化物酶氧化和线粒体氧化，同时还能调节脂质的摄取和贮存，在脂质代谢中占有重要地位，在维持体内脂质代谢的动态平衡中起到枢纽作用[3]。

中医学中并无与胰岛素抵抗相对应的病名，根据其临床表现可诊断为眩晕、湿阻、消渴等疾病，认为其发病多与痰湿、脾虚、气虚、血瘀等几方面有关。红景天为景天科红景天属植物高山红景天和狭叶红景天的干燥全草，因其花、茎、根及其浸液均呈红色而得名，具有益气补血、活血化瘀、通脉止痛、扶正固本、调和阴阳、益气补血、滋补强身等作用。近年来研究表明，红景天提取物对延缓机体衰老、防止老年疾病、改善心肌缺血缺氧、改善心律失常、调节脂质代谢紊乱等疾病都有很好的疗效[4]。

本实验结果表明，红景天提取物可使高脂饮食诱导的高脂胰岛素抵抗大鼠血清TG、TC及FFA明显降低，调节FPG平衡，降低FINS水平，增加GIR，提高胰岛素敏感性。通过荧光定量PCR法测定显示，红景天提取物可显著增加大鼠肝脏PPAR-γ mRNA的表达，提示其可能通过作为PPAR的配体，激活PPAR受体并使其活化，从而启动了一系列与糖脂代谢有关酶的基因转录，促进脂肪氧化分解，从而增强胰岛素敏感性，为临床应用中医药防治胰岛素抵抗提供了理论依据，也为进一步研究中医药治疗心血管和内分泌疾病提供新的治疗靶点。

[1] 韩勇，沙杜鹃，张均.过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子-1α在脑缺血中的神经保护作用[J].国际脑血管病杂志，2012，20(8)：631-636.

[2] Kraegen EW，James DE，Bennett SP，et al.In vivo insulin sensitivity in the rat determined by euglycemic clamp[J].Am J Physiol，1983，245(1)：E1-7.

[3] Banner CD，Gottlicher M，Widmark E，et al.A systematic analytical chemistry/cell assay approach to isolate activators of orphan nuclear receptors from biological extracts：characterization of peroxisome proliferator-activated receptor activators in plasma[J].J Lipid Res，1993，34(9)：1583-1591.

[4] 赵文，王庭欣.藏产红景天混合提取物对BALB/c小鼠免疫功能的影响[J].实验动物科学与管理，1998，15(2)：2-4.

(本文编辑：石 康)

EffectofRhodiolaroseaextractontheexpressionofPpar-γininsulinresistancehyperlipidrathepatic

WANGZhengrong*,ZHANGHongyan,LINGXin,etal.

*TumorDepartmentTwo,HebeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Hebei,Shijiazhuang050011

ObjectiveTo observe the effect of Rhodiola rosea extract on insulin sensitivity and the expression of Ppar-γ in rats with insulin resistance induced by diets.Methods70Wistar rats were randomly divided into two groups, normal control group (n=20) and hyperlipid model group (n=50).Normal control group given basic feed, hyperlipid model group was given a high-fat feed, feed four weeks later each line 10rats were randomly selected high insulin - glucose clamps test to determine whether a building is successful, confirmed after the success of the building will be residual fatty model group rats were randomly divided into the hyperlipid control group and hyperlipid + rhodiola intervention group, each group of 20rats.Rats in hyperlipid + rhodiola intervention group were given Rhodiola rosea extract (1g/kg·d).Rats in normal control group and hyperlipid control group were given equal amount of 0.9% sodium chloride injection by intragastric administration.After four weeks The changes of TG, TC, FFA, FBG and FINS in each group were observed, GIR changes and the expression of Ppar-γ mRNA were recorded.ResultsFBG and FINS of rats in hyperlipid model group were increased obviously compared with those in normal control group (P<0.05), GIR was deceased (P<0.05).The levels of TG, TC and FFA in hyperlipid model group were increased obviously compared with those in normal control group (P<0.05).The levels of TG, TC and FFA in hyperlipid + rhodiola intervention group were decreased obviously compared with those in hyperlipid model group (P<0.05).The levels of TG, TC and FFA were comparable level with the control group (P> 0.05).The level of the expression of Ppar-γ mRNA in hyperlipid control group was rather with that in normal control group (P>0.05).The level of the expression of Ppar-γ mRNA in hyperlipid + rhodiola intervention group was significantly increased as compared with that in hyperlipid model group and normal control group and control group (P<0.05).ConclusionRhodiola rosea extract has obvious improvement role on insulin resistance of rats, significantly lower serum TG, TC and FFA, adjust the balance of FBG, lower levels of FINS, increase the GIR, improve insulin sensitivity and its mechanism may be related to increase insulin resistance in rat liver cells ppar-gamma mRNA expression

Insulin resistance；Rhodiola rosea；Peroxisome proliferator-activated receptor；Rat；Animal；Experiment；RNA

王峥嵘(1980—)，女，主治医师，硕士。从事中医内科临床工作。

R-332；R285.5

A

1002-2619(2014)10-1548-04

2013-11-19)

1 华北石油管理局总医院内分泌科，河北 任丘 062552

2 华北石油机关社区卫生服务中心，河北 任丘 062552

3 河北省人民医院内分泌科，河北 石家庄 050051

4 河北省中医院治未病科，河北 石家庄 050011

5 华北石油管理局总医院心内二科，河北 任丘 062552