大黄酚对脑缺血再灌注小鼠肺组织过氧化氢和过氧化氢酶的影响※

王四海 郭 桢 张秀敏 韩培天 温塘芳 王 树

(河北北方学院附属第二医院心胸外科，河北 宣化 075100)

大黄酚对脑缺血再灌注小鼠肺组织过氧化氢和过氧化氢酶的影响※

王四海 郭 桢1张秀敏 韩培天 温塘芳 王 树2

(河北北方学院附属第二医院心胸外科，河北 宣化 075100)

目的研究大黄酚(chrysophanol，Chry)对脑缺血再灌注(IR)后小鼠肺组织中过氧化氢(H2O2)及过氧化氢酶(CAT)的影响，探讨大黄酚对脑IR后对肺损伤的保护作用机制。方法取昆明种小鼠80只，3.5%水合氯醛麻醉后，制备小鼠IR模型。将造模成功的74只小鼠随机分为5组，药物组(IR+Chry)45只，分为高、中、低剂量3个组，各15只，模型组15只，假手术组14只。药物组于缺血前30min 分别腹腔注射大黄酚10.0、1.0、0.1mg/kg；模型组于缺血前30min 腹腔注射溶剂10mL/kg；假手术组只进行手术，但不进行脑IR，腹腔注射溶剂10mL/kg。模型组和药物组小鼠恢复血供后10min快速断头处死，取肺组织，制成10% 肺组织匀浆，测定小鼠肺组织中H2O2含量和CAT活力。结果与假手术组比较，模型组小鼠肺组织内H2O2含量明显增加(P<0.05)，肺组织内CAT活力明显降低﹙P<0.05)；与模型组比较，高剂量大黄酚组小鼠肺组织内H2O2含量明显减少(P<0.01)。与模型组比较，高剂量大黄酚组小鼠肺组织内CAT活力明显提高(P<0.01)。结论大黄酚对脑IR肺损伤的保护作用可通过提高肺组织中CAT活力起作用。

脑缺血再灌注；肺脏损伤；过氧化氢；过氧化氢酶；大黄酚

大黄酚(chrysophanol，Chry)为大黄的有效成分之一，有研究表明Chry对脑缺血再灌注(IR)所致小鼠记忆功能损伤有明显的保护作用[1]，但关于Chry对脑IR引起肺损伤的保护作用报道少见。我们拟通过采用小鼠短暂性脑缺血模型观察Chry对脑IR后小鼠肺组织中过氧化氢(H2O2)含量及过氧化氢酶(catalase，CAT)活力变化的影响，探讨Chry对脑IR所致肺损伤的保护作用机制，为其应用于临床治疗脑血管疾病引起的肺组织损伤的保护作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

1.1.1 动物 昆明种小鼠80只，体质量 (28±2)g，雌雄不拘，中国医学科学院北京药物研究所提供，许可证号：(京)2004200012。

1.1.2 药物与试剂 大黄酚(中国药品生物制品检定所，纯度≥98%，批号110796-200412)，实验前用N，N-dimethyl-Formamide溶解，聚山梨酯-80助溶，0.9%氯化钠注射液稀释至所需浓度。N，N-dimethyl-Formamide∶聚山梨酯-80∶0.9% 氯化钠注射液为1∶1∶8。CAT可见光试剂盒及H2O2试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 仪器 FSH-2内切式组织可调高速匀浆器(江苏大地自动化仪器厂)；LabTech全自动紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；二列六孔电热恒温水浴锅(北京精科华瑞仪器有限公司)；Sigma3K30高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 3.5%水合氯醛(10mL/kg，腹腔注射)麻醉小鼠，仰卧位固定，自胸骨柄到下颌骨间行5～8mm正中纵向切口，分离两侧颈总动脉，分离后用液体石蜡浸泡过的黑色手术线穿过左右二侧颈总动脉，尽量恢复两侧颈总动脉到原位，黑色手术线在气管上方打松反手结，结的松紧以不压迫气管为宜。在每侧颈总动脉上方的黑线上穿过一条用液体石蜡浸泡过白色手术线，按文献[2]方法埋线后缝合切口。术后48h将颈下部黑色手术线拉紧，阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态，5min后轻拉两侧白色手术线，使颈总动脉恢复血液再灌注[1]。

1.2.2 实验分组 造模成功74只，术后48h将清醒、活动正常的造模成功的74只小鼠随机分为5组，药物组(IR+Chry)45只，分为高、中、低剂量3个组各15只，于缺血前30min 分别腹腔注射大黄酚10.0、1.0、0.1mg/kg；模型组15只，于缺血前30min 腹腔注射溶剂10mL/kg；假手术组14只，进行手术，但不进行脑IR，腹腔注射溶剂10mL/kg。

1.2.3 小鼠肺组织内H2O2含量及CAT活力的测定 模型组和药物组小鼠恢复血供后10min快速断头处死，在0.9%氯化钠注射液冰块上迅速取肺组织，4℃ 0.9%氯化钠注射液冲洗，滤纸吸干，置于1mL离心管内，并置于Forma-86c ULT 冰柜内冷冻贮存。实验时取出制成10% 肺组织匀浆，3500～4000r/min，-4℃低温离心10min后取适量上清液测定H2O2含量和CAT活力。每mg组织蛋白每s分解1μmol的H2O2的量为一个CAT活力单位。

2 结 果

2.1 各组肺组织中H2O2含量比较 见表1。

组 别n剂量(mg/kg)H2O2假手术组14-39．1±9．8模型组15-51．0±10．2∗高剂量大黄酚组1510．022．3±6．7△中剂量大黄酚组151．049．2±10．2低剂量大黄酚组150．150．8±13．1

与假手术术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.01

由表1可见，与假手术组比较模型组小鼠肺组织内H2O2含量明显增加，差异有统计学意义﹙P<0.05)；与模型组比较高剂量大黄酚组小鼠肺组织内H2O2含量明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 各组肺组织中CAT活力比较 见表2。

组 别n剂量(mg/kg)CAT假手术组14-10．5±4．2模型组15-6．3±3．1∗高剂量大黄酚组1510．011．5±5．0△中剂量大黄酚组151．05．4±4．1低剂量大黄酚组150．16．1±1．5

与假手术术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.01

由表2可见，与假手术组比较模型组小鼠肺组织内CAT活力明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较高剂量大黄酚组小鼠肺组织内CAT活力明显提高，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

在IR的临床治疗过程中，患者在接受治疗后缺血的脑组织得到再灌注，可引起能量代谢障碍及缺氧，导致神经元缺血性死亡。脑缺血和缺血性再灌注可引起胞内Ca2+超载、细胞膜功能受损，毒性自由基产生，脑能量耗竭，兴奋性氨基酸(EAA)释放增加及细胞肿胀、凋亡和坏死等。脑IR导致的脑组织缺血、缺氧可引起缺血期原发性损伤及再灌注期继发性损伤[3]。寻找有效的脑缺血疾病预防和治疗药物，在病理早期防治损伤进一步扩大，是当今国内外脑缺血疾病治疗学研究的重点课题。

IR会严重影响肺功能，甚至引起肺功能障碍，再灌注损伤发生的病理生理基础是缺血、缺氧，由此启动肿瘤坏死因子(TNF)、花生四烯酸代谢产物如血栓素A2(TXA2)、白三烯B4(LTB4)等以及超氧化基团(ROIs)等因子合成和释放的增加。这些因子除独立发挥各自生物学功能外，还可相互影响、互为因果，引起血小板、白细胞聚集、脱颗粒及生物膜磷脂过氧化反应，大分子物质降解，释放血管活性物质，增加血管通透性，升高肺血管阻力。参与再灌注损伤的这些因子将炎症、活性氧基团及排异反应融合贯穿在一起，缺血再灌注对肺功能的影响，也是这3个主要方面共同作用的结果。因此，对IR损伤病理过程的研究和认识，有利于采取和加强针对性预防措施，提高肺保护质量，为改善肺功能提供可靠的保证。

CAT是H2O2催化分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。H2O2是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%。H2O2是活跃的强氧化剂，能通过氧化反应破坏细胞新陈代谢产生一系列新的氧化性活跃物质—自由基，而CAT是细胞内抗氧化酶，能够消除细胞新陈代谢的副产物— H2O2。本研究结果表明，Chry可增强脑IR小鼠肺组织中CAT活性，促进H2O2分解，减少肺组织中H2O2含量，进而减少氧自由基的生成及脂质过氧化反应，提示Chry可减轻氧自由基对细胞的损伤，提高机体抗氧化酶的活性。有学者研究后认为，Chry对离体小鼠过氧化脂质有明显的抑制作用[4]，进一步提示Chry减少自由基对肺组织损伤、增强肺组织中CAT活力是其保护脑IR引起肺损伤的重要机制之一。

[1] 王树，张丹参，张力，等.大黄酚对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用[J].中国老年学杂志，2009，29(15)：1934-1936.

[2] Himori N，Watanabe H，Akaike N，et al.Cerebral ischemia model with conscious mice：involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability[J].J Pharmacol Meth，1990，23：311-327.

[3] 韩敏，刘艳凯，薛茜.脑缺血再灌注损伤的研究进展[J].河北北方学院学报：医学版，2006，23(5)：75-78.

[4] 李超，张丹参，赵晓倩，等.三种大黄酚制剂改善脑缺血/再灌注小鼠记忆功能的实验筛选研究[J].中国药理学通报，2010，26(12)：1607-1612.

(本文编辑：董军杰)

Effectsofchrysophanolonhydrogenperoxideandcatalaseinlunginjuryinducedbycerebralischemiareperfusionofmice

WANGSihai*,GUOZhen,ZHANGXiumin,etal.

*DepartmentofCardiothoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Hebei,Xuanhua075100

ObjectiveTo study the effects of chrysophanol on hydrogen peroxide and catalase in lung injury induced by cerebral ischemia reperfusion in mice and further analyze the related mechanisms of protective effect on lung injury induced by cerebral ischemia reperfusion.MethodsCerebral ischemia reperfusion models of mice were prepared with 90Kunming mice anesthetized by 3.5% chloral hydrate.The models of 74mice that prepared successfully were randomly divided into five groups: sham-operated group(14mice, operate but not do cerebral ischemia reperfusion ), model group(IR, 15mice, operate and do cerebral ischemia reperfusion), high dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 10mg/kg), middle dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 1mg/kg), low dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 0.1mg/kg).Mice of model group and chrysophanol group were beheaded quickly when blood flow is restored after ten minutes, and then lung tissues were taken out of beheaded mice to make 10% lung homogenate.H2O2and CAT activities in lung were measured.ResultsCompared with sham-operated group, the content of H2O2of model group was increased, and the activities of CAT was decreased, and there were statistical differences﹙P<0.05)；Compared with model group, Chrysophanol could decrease the content of H2O2(Chry10.0, Chry1.0mg/kg，P<0.01)and increase the activities of CAT(Chry10.0mg/kg，P<0.01) in lung of mice induced by cerebral ischemia reperfusion.ConclusionProtective effects of chrysophanol on lung injury of cerebral ischemia reperfusion can be affected by increasing the activity of CAT in the pulmonary tissue.

Cerebral ischemia reperfusion；Lung injury；Hydrogen peroxide；Catalase；Chrysophanol

※ 项目来源：张家口市科学技术研究与发展指导计划项目(编号：1221015D)

王四海(1970—)，男，副主任医师，硕士。从事多器官损伤保护研究工作。

R-332；R284.1；R563.02；R619.901

A

1002-2619(2014)10-1546-03

2014-05-13)

1 河北省宣化县新型农村合作医疗管理办公室，河北 宣化 075100

2 河北北方学院药学系，河北 张家口 075000