L-鸟氨酸脱羧酶抑制剂筛选模型的建立

郝秀菊 刘志辉 栾文姬 王锋 苏丽娜 陈俊峰

·论著·

L-鸟氨酸脱羧酶抑制剂筛选模型的建立

郝秀菊 刘志辉 栾文姬 王锋 苏丽娜 陈俊峰

目的基于酶促反应法，利用HPLC测定腐胺含量，评价待筛选药物对PC-3M细胞中L-鸟氨酸脱羧酶(L-ODC)活性的影响,建立鸟氨酸脱羧酶抑制剂的筛选模型。方法将与药物反应后的细胞处理样本，以TSKge lODS- 80TM凝胶色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)为分析柱，在甲醇-水(8∶2)保持3 min，从4 min到14 min，甲醇比率由80%梯度增至100%梯度洗脱,流速为0.8 ml/min,激发波长为340 nm，发射波长为515 nm，柱温为50℃，进样量10 μl。按内标法定量。结果ODC特异性抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)对ODC活性的抑制率为(59.3±5.4)%，雷帕霉素对ODC活性的抑制率为(29.8±6.4)%，姜黄素对ODC活性的抑制率为(26.1±6.6)%。结论本模型通过测定药物对ODC细胞内鸟氨酸脱羧酶的作用，利用HPLC分离法测定在药物抑制影响下的鸟氨酸脱羧酶的活性，这一模型有望成为筛选ODC抑制剂的快速方便准确的检测方法。

L-鸟氨酸脱羧酶；L-鸟氨酸脱羧酶抑制剂；筛选模型

鸟氨酸脱羧酶(ODC)在人体内普遍存在，参与到鸟氨酸的代谢，其发挥作用的辅酶是磷酸吡哆醛，其仅占到人体细胞总的可溶性蛋白质的0.016%[1]，但是起到的作用十分重要。在人体多胺生物合成过程中，利用ODC催化鸟氨酸转化成腐胺[2]，是一种限速酶。而精脒/精胺乙酰转移酶(SSAT) 是参与多胺分解代谢的关键酶,其主要作用是催化精胺和精脒转化为腐胺[3]。有研究表明，在肿瘤组织中ODC的活性显著高于正常组织，因此鸟氨酸脱羧酶成为现在的较为热点的抗癌药物靶标[4]。然而，目前虽然作为抗癌药物的ODC抑制剂是抗癌药物研究的热点之一，但是筛选抗癌药物模型较为单一，主要是使用传统的方法测定并评价，测定的结果误差较大且不够准确，而本次试验建立的ODC抑制剂筛选模型的测定方法，主要采用衍生化的高效液相色谱分析(HPLC)的方法测定ODC酶促反应后的产物。本研究方法是测定ODC催化L-鸟氨酸脱羧基反应，在一定的时间内生成的产物量，由于其产物生成的量与ODC的活性成正比，因此ODC抑制剂的作用效果可以通过产物生成的减少量来反应。在ODC与L-鸟氨酸反应过程中，其产物能够与特定的物质反应，反应后的衍生物经过高效液相色谱仪(HPLC)分析后，经过的高灵敏度的分离得到产物腐胺，由于其衍生物具有荧光信号，因此仅需要检测荧光信号的强弱就能测定产物腐胺的生成量，以此反映ODC的催化活性[5]，以及不同目标药物对该酶催化活性的抑制作用，进而进行ODC抑制剂的筛选。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 细胞高糖培养基，胎牛血清(Gibco 公司)，RNase A、磺酰罗丹明B (SRB)、鸟氨酸(Ornithine)、二氟甲基鸟氨酸(DFMO)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、5-磷酸吡哆醛、(Sigma 公司)，美国戴安SUMM IT系列高效液相色谱仪(包括ASI-100自动进样器,P680高压泵,RF-2000荧光检测器，TCC-100柱温箱);旋涡混合震荡器；JY92-2D超声波细胞粉碎机;TGL-16G高速冷冻离心机。

1.2 细胞株 本次试验所用的细胞株为人前列腺癌细胞(PC-3M细胞)，由本院细胞库提供。其主要的培养液为RPMI1640培养液。培养液中:加入10%的四季青小牛血清，加入青霉素和链霉素，其终浓度为100 mg/L。培养条件为37℃和5% CO2培养箱中培养。

1.3 方法

1.3.1 腐胺标准品储备液配制：利用精密电子天平准确称取腐胺标准品10 mg,加入到10 ml的容量瓶中,然后加入0.1 mmol/ml盐酸溶液，加到容量瓶的刻度线,震荡摇匀至澄清即可，其浓度为1.0 mg/ml。

1.3.2 药物筛选细胞样本的制备：选择处于对数生长期的PC-3M 细胞配制成浓度为1×105个/ml的细胞悬液。吸取5 ml接种到直径为6 cm的塑料小平皿中，37℃培养24 h。然后向平皿中加入不同浓度的待筛选药物，继续培养24 h[其中以磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照]。将培养后的细胞收集，利用磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，用作酶提取液(其中PBS 50 mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)0.1 mmol/L，二硫苏糖醇(DTT) 5 mmol/L，5-磷酸哆醛0.2 mmol/L),pH值7.2；底物溶液成分为磷酸缓冲液50 mmol/L，pH值7.2，EDTA 0.1 mmol/L， DTT 5 mmol/L，5-磷酸吡哆醛0.2 mmol/L，鸟氨酸5 mmol/L,400 μl悬浮细胞，冻融法破碎细胞(即液氮-37℃反复冻融3～4次)，离心15 000×g，10 min，4℃，收集上清溶液即为待测定组酶溶液。

1.3.3 色谱条件的确定：色谱柱: TSKgelODS-80TM 凝胶色谱柱(150 mm×46 mm,5 m)；流动相: 甲醇与水的浓度为80%。80%甲醇流动相保持3 min,从第4分钟开始逐渐提高甲醇的浓度，到第14 分钟时，甲醇的浓度增高至100%。荧光的激发光波长为340 nm,荧光的发射光波长为515 nm。温度控制为50℃；洗脱液的流速为0.8 ml/min；样本的进样量为10 μl。

1.3.4 酶活力的测定：用加样器取1 ml的洗脱上清液,加入到5 ml的离心管中,再加入200 μl浓度为3 mmol/L的鸟氨酸盐酸盐,振荡混匀1 min,之后，将5 ml的离心管置于的恒温37℃水浴中反应60 min,用加样器加入100 μl浓度为20% 三氯乙酸溶液来终止反应。然后用加样器向反应液中加入50 μl浓度为0.01 mg/ml的腐胺标准溶液，300 μl的浓度为5 mg/ml的DNS-Cl丙酮溶液，150 μl的pH值调整为10的碳酸盐缓冲溶液，震荡混匀,提高恒温水浴至70℃，在避光的条件下，反应40 min。反应完成后马上用加样器加入25 μl的脯氨酸，继续反应20 min。反应完成后用400 μl的甲苯分成2次萃取,萃取物用氮气吹干后溶于400 μl甲醇中,使用微孔滤膜在无菌的条件下过滤后,取10 μl上样。

1.3.5 回归方程计算：利用加样器吸取腐胺标准品储备液50 μl，然后利用0.1 mmol/ml的盐酸配制成系列腐胺标准品浓度(1.134、5.67、11.344、22.688、45.376、68.064 mol/L)分别按照上述反应条件进行反应。反应完成后,利用加样器精密吸取10 μl对色谱仪进行上样,根据所得面积,计算回归方程,所得方程为:Y=0.2622X-0.5353，r=0.9988。

1.3.6 精密度试验：利用上述配制的浓度为22.688 μmol/L腐胺标准品，进行衍生化反应。每次加样10 μl，分10次加样，每次加样后进行分析其峰图面积和保持的时间长度，RSD(n=10)记录为0.15%和0.19%。

1.3.7 ODC酶反应动力学研究

1.3.7.1 反应时间与酶促反应速率的关系：在酶促反应的过程中,反应速率随着时间的变化呈现出一定关系。选经“1.3.2” 项中洗脱后所的得到的上清液(未经药物作用的空白组),在37℃水浴条件下反应10～50 min。发现在反应的0～40 min内,反应速率与时间几乎呈正比；40 min后的反应速率随着反应时间的延长而呈现降低的趋势。见图1。

图1 反应时间与反应速率的关系

1.3.7.2 不同药物对对ODC反应速率的影响：在本次试验的ODC反应过程中，ODC的量也对其总的活性有影响，和试验进程中的反应速率之间有着直接相互关系。在控制ODC的量不变时，其反应的酶活性对反应的速率起决定性作用。将“1.3.2”项下不同药物添加到反应液中，反应后取等量得细胞上清液(0～1 ml)，按照“1.3.4”项的反应条件下进行反应，测定ODC活性与反应速率的相互关系，反应速率随着抑制率的加强而减小，呈现一种负相关的关系。

1.3.7.3 底物浓度对反应速率的影响：在本次研究中,控制ODC的条件一定时，随着底物浓度的增加，反应速率也会出现明显的变化，说明底物浓度与反应速率存在相关性，属于酶促反应的典型特征。取反应后的上清液1 ml，分别与200 μl不同浓度的鸟氨酸盐进行反应，当其变化范围在0～3 mmol/L时，两者的反应速率表现出显著的酶促反应特征，表现为一条双曲线的形式。就此特征表明两者的反应可以认为是酶促反应的形式。

1.3.7.4 利用动力学方程测定米氏方程Km：ODC催化其底物L-鸟氨酸脱羧生成腐胺,该反应属于酶促反应，通过计算得出其米氏方程的Km值。

2 结果

2.1 不同ODC抑制剂对酶活性的影响 将已知的ODC的特异性抑制剂：二氟甲基鸟氨酸、雷帕霉素和姜黄素分别加到“1.3.4”项的反应体系中按照其反应条件进行反应。同时以不加入ODC的特异性抑制剂的反应体系作为空白对照。按照“1.3.5”项所确定的回归方程Y=0.2622X-0.5353Y进行计算，与空白对照进行比较得出不同ODC特异性抑制剂对ODC的抑制率。不同ODC抑制剂对酶活性的影响，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。见表1。

指标空白二氟甲基鸟氨酸空白雷帕霉素空白姜黄素鸟氨酸脱羧酶活性0．91±0．050．37±0．050．94±0．070．66±0．060．91±0．070．65±0．06 P值<0．01<0．05<0．05

2.2 抑制率情况 ODC特异性抑制剂二氟甲基鸟氨酸对ODC活性的抑制率为(59.3±5.4)%，雷帕霉素对ODC活性的抑制率为(29.8±6.4)%，姜黄素对ODC活性的抑制率为(26.1±6.6)%。

3 讨论

本次研究中在选用的细胞系的时候，第一我们考虑到自己实验室的保存的细胞株，第二通过查阅文献发现人前列腺细胞系是一种较好的细胞系，主要原因是ODC的表达较高[6，7]。所以本次研究的主要的测试细胞选为PC-3M。

DNS-Cl是一种应用最广的HPLC衍生试剂,它可与腐胺等物质发生反应。它在多方面对衍生化反应有着重要的影响。首先是浓度的影响，分别考察了DNS-Cl是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/ml时衍生试剂的量对衍生反应产物量和色谱峰的影响。通过本次试验发现，当发生反应的DNS-Cl浓度控制在7 mg/ml时，通过高效液相色谱法检测到的腐胺衍生物的图峰面积的值是最大的。其次是pH值对试验结果的影响也是至关重要的，我们在试验中发现，只有在pH值为10的时候，所得到的图峰面值最大，主要原因是DNS-Cl在酸性的环境下易水解,此研究表明，本次反应的速率会受到反应环境pH值的影响。温度的选择也是很重要，温度的变化会影响酶活性，影响反应的速率和反应后的产物的生成量，此次研究表明，本次反应的速率会收到反应体系温度的影响。此外，时间的长短也会影响反应的进行，随着时间的延长，酶促反应的速率明显受到影响。经过本次试验的条件摸索，反应的条件设定在 70℃，反应时间保持40 min，是最合适的条件。

本研究中，我们也对体系进行了探索，发现当甲醇和水的比例保持在(8∶2)时候其效果最好，80%甲醇流动相保持3 min后,从第4分钟开始逐渐提高甲醇的浓度，到第14 分钟时，甲醇的浓度增高至100%，分离度很好，峰形也很好。

本模型通过药物对PC-3M细胞的作用，利用高效液相色谱法进行测定，考察了在不同ODC抑制剂作用下的ODC的活性,并对其酶反应动力学进行了研究。使用高效液相色谱仪的净化衍生的方法替代传统的方法,提高了灵敏度和准确度，此外，我们运用动力学方法的讨论并完善了其检测的条件,使之形成统一的用于检测ODC活性的标准,此外该方法的操作较为简单，稳定性较好，易于临床的推广。更重要的是，利用该模型筛选特异性强，不良反应小，选择抑制能力高的抑制剂，可以进一步开发成多种新型抗肿瘤药物。因此这种方法对于肿瘤的治疗有极高的应用价值。

1 Ngo TT,Brillhart KL,Davis RH,et al.Spectrophotometric assay for ornithine decarboxylase.Anal Biochem,1987,160：290-293.

2 赵君庸.多胺免疫组织化学方法的建立及在肺癌研究中的应用.国外医学临床生物化学与检验学分册，1983,4:22.

3 Almrud JJ,Oliveira MA,Grishin NV,et al.Crystal structure of human ornithine decarboxylase at 2.1 A resolution:structural insights to antizyme binding.J Mol Biol,2000,295:7-16.

4 Luk GD.Ornithine decarboxylase as a biologic marker in familial colonic polyposis.N Emg J Med,1984,311:80.

5 沈希强.多胺及其与癌症的关系.国外医学肿瘤学分册,1990,17:82.

6 Liu XX,Wang L,Lin Y,et al.Ornithine decarboxylase activity and its gene expression are increased in benign hyperplastic prostate.Prostate,2000，43：83-87.

7 Victor A,Levin Q,Jacob L,et al.Tissue-based assay for ornithinedecarboxylase to identify patients likely to respond to difluoromethyl ornithine.J Histochem Cytochem,2004,52:1467.

TheestablishmentofscreeningmodelofL-ornithinedecarboxylaseinhibitor

HAOXiuju*,LIUZhihui,LUANWenji,etal.

*DepartmentofICU,TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo evaluate the effect of screening drugs on activity of L-ornithine decarboxylase (L-ODC) in PC-3M cells by means of HPLC,and to establish the screening model of L-ornithine decarboxylase inhibitor.MethodsA TSKge lODS- 80TM column (150mm×4.6mm,5μm) was used for chromatographic separations,in gradient conditions at 0.8ml/min,with the mobile phase composed by water-methanol.The initial mobile phase was composed by 80% methanol,20% water,maintained for 3min.Then during 4～14min,the composition was linear changed to 100% methanol,maintained for 3 min.The excitation wavelength was set at 340nm and emission wavelength was 515nm.The injection volume was 10μl.ResultsThe inhibition rate of difluoromethylornithine (DMFO) to the activity of L-ODC was(59.3±5.4)%,the inhibition rate of rapamycin to activity of L-ODC was (29.8±6.4)% and the inhibition rate of curcumin to the activity of L-ODC was (26.1±6.6)%.ConclusionThe model established by detecting the effect of L-ornithine decarboxylase in cells and detecting the activity of L-ornithine decarboxylase by means of HPLC may become a rapid,accurate,convenient detection method for screening ODC inhibitor.

L-ornithine decarboxylase;L-ornithine decarboxylase inhibitor;screening model

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.005

050011 河北省石家庄市第三医院ICU室(郝秀菊)，科教科(王锋)；河北省藁城市中西医结合医院骨科(刘志辉)；河北省石家庄市井陉矿区疾病预防控制中心(栾文姬)；石药集团河北中润制药有限公司(苏丽娜、陈俊峰)

R 965.1

A

1002-7386(2014)21-3217-03

2014-04-11)