131I-chTNT诱导淋巴瘤Raji细胞凋亡的实验研究

孙步彤，毕林涛，干慧珠，卢振霞，马庆杰，高 识，代恩 勇，赵亚男， 魏淑芳

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins Lymphoma,NHL)是一组起源于淋巴结、骨髓、脾脏等淋巴组织的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居恶性肿瘤第5位。近年来，NHL在世界范围内的发病率有持续增长趋势，可能与人口老龄化、HIV感染和环境污染等有关。尽管目前标准化疗对NHL的有效率较高，但复发率也高，且再治疗缓解率低，缓解时间短、毒副反应大。探索和发现治疗恶性淋巴瘤的新的策略，已成亟待解决的问题。放射免疫治疗(RIT)是一种崭新的分子靶向治疗，目前对RIT的研究多集中在血液系统及消化系统恶性肿瘤，特别在淋巴瘤治疗取得较好疗效。碘[131I]肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液(简称131I-chTNT注射液)是放射性核素碘131标记的生物导向制剂，靶向肿瘤坏死区中变性坏死的细胞核，属嵌合抗体(chimeric antibody)[1]。目前国内外尚未见131I-chTNT关于治疗NHL的文献报道。本研究以淋巴瘤Raji细胞为对象，应用131I-chTNT、131I和生理盐水处理淋巴瘤Raji细胞，FCM技术检测细胞凋亡的变化。研究131I标记的肿瘤细胞核嵌合单克隆抗体对恶性淋巴瘤的生物学效应，并对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司，131I-chTNT由中国上海美恩生物技术有限公司提供。人淋巴瘤细胞株Raji为本实验室保存并培养。

1.2方法将保存的人淋巴瘤细胞Raji细胞接种于含10%血清的RPMI 1640完全培养液中，在37℃含5%CO2的湿润孵箱中培养，2-3 d传代1次。选对数生长期细胞，按每孔2×106/ml接种于96孔培养板中，将Raji细胞分为3组，即空白对照组(加入100 μl生理盐水)、单纯核素131I(加入100 μl)组及131I-chTNT组(加入100 μl131I-chTNT 100 ng/ml)，每组均设3个复孔。24小时后，1 000 rpm离心5 min，收集各组细胞，以PBS洗涤。离心去PBS，加入预冷的70%的冰乙醇固定，4℃ 24 h。离心弃去固定液，3 ml PBS重悬5 min。500 rpm离心5 min，弃去PBS。加入1 ml PI染液，4℃避光30 min。流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。将被检细胞混匀后，上FCM进行单参数分析。用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。

1.3统计学分析采用SPSS 11.0统计软件包处理，两两比较采用配对t检验。

2 结果

不同实验组细胞经处理后，收集细胞进行FCM检测，结果显示：131I-chTNT治疗组出现了明显的细胞凋亡，流式细胞仪检测出典型凋亡峰(即在G1期前出现的亚二倍峰)，见图1-图3。Raji细胞对照组凋亡率1.0%，单纯核素治疗组为1.62%,131I-chTNT治疗组为13.61%，131I-chTNT治疗组与单纯核素治疗组和空白对照组比较均有明显差异，单纯核素治疗组略高于空白对照组，见表1。

表1 不同实验组Raji细胞的凋亡诱导作用

图1空白对照组图2核素治疗组图3131I-chTNT治疗组

3 讨论

放射免疫治疗(RIT)是众多肿瘤免疫靶向治疗的一种，即利用特异性抗体作载体，与能释放射线的放射性核素偶合，借助与抗体结合的放射性核素发射射线杀伤肿瘤靶细胞[2]。放射免疫治疗的药物注入体内后与肿瘤细胞特异性的结合，对正常组织影响较小。

碘[131I]肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液(131I-chTNT注射液)是放射性核素碘131标记的生物导向治疗制剂，该单克隆抗体靶向于肿瘤坏死区中变性坏死的细胞核，具有广谱的抗肿瘤活性。131I-chTNT与以往的放射免疫治疗不同，它利用恶性肿瘤的具有大量坏死组织特点，特异结合肿瘤坏死区的细胞核，从而对多种肿瘤均有效。是已应用于放化疗不能控制的、复发的晚期肺癌的新药[3-4]。Yu L等[5]报道了应用131I-chTNT治疗43例进展期肺癌患者，静脉注射以及肿瘤内局部注射都取得了较好疗效。此外，Ma报道了131I-chTNT在甲状腺癌肺转移患者体内的生物学分布，提示该药物有望应用于甲状腺癌肺转移的患者[6]。但目前国内外均未见131I-chTNT关于治疗淋巴瘤的文献报道。

本研究以淋巴瘤Raji细胞为研究对象，应用131I-chTNT、131I以及生理盐水处理淋巴瘤Raji细胞，然后FCM技术检测各组细胞凋亡的变化。从而研究131I标记的肿瘤细胞核嵌合单克隆抗体对恶性淋巴瘤的生物学效应。实验结果显示131I-chTNT治疗组Raji细胞出现了明显的细胞凋亡。证明131I-chTNT能够诱导淋巴瘤细胞凋亡，提示该药物具有抑制淋巴瘤细胞增殖的作用。

总之，肿瘤放射免疫治疗是新的治疗方法，为难治复发性NHL治疗提供有开创性的新途径。131I-chTNT已显示了较强的诱导淋巴瘤细胞凋亡、抑制淋巴瘤细胞增殖的作用。通过131I-chTNT对淋巴瘤Raji细胞生物学效应的实验研究，能为临床应用提供实验依据。但131I-chTNT应用于淋巴瘤的安全性及远期毒性问题仍需进一步临床试验及追踪观察。

参考文献：

[1]Wang H,Cao C,Li B,et al.Immunogenicity of Iodine 131 chimeric tumor necrosis therapy monoclonal antibody in advanced lung cancer patients[J].Cancer Immunol Immunother,2008,57(5):677.

[2]Navarro-Teulon I,Lozza C,Pèlegrin A,et al.General overview of radioimmunotherapy of solid tumors[J].Immunotherapy,2013,5(5):467.

[3]Chen S,Yu L,Jiang C,Zhao Y,et al.Pivotal study of iodine-131-labeled chimeric tumor necrosis treatment radioimmunotherapy in patients with advanced lung cancer[J].J Clin Oncol,2005,23(7):1538.

[4]Hdeib A,Sloan A.Targeted radioimmunotherapy:the role of131I-chTNT-1/B mAb (Cotara) for treatment of high-grade gliomas[J].Future Oncol,2012,8(6):659.

[5]Yu L,Ju DW,Chen W,et al.131I-chTNT radioimmunotherapy of 43 patients with advanced lung cancer[J].Cancer Biother Radiopharm,2006,21(1):5.

[6]Ma Q,Gao S,Zhao J,et al.Biological distribution of131I-labeled anti-nucleus antigen monoclonal differentiated thyroid carcinoma[J].Nuclear Science and Techniques,2008,19(4):230.