改良冷配Schiff染液在肾穿刺活检病理检查中的应用

娄 岩，刘树军，高 丹，孙东晗，田向辉

(吉林大学第二医院 肾病内科,吉林 长春130041)

肾活检穿刺术是在彩超引导下经皮肾脏组织穿刺，以了解肾脏组织形态学改变，为临床医生判断病情、治疗疾病和估计预后方面提供了重要的依据，肾脏病理检查结果已经成为肾脏疾病诊断的重要方法之一。过碘酸-雪夫氏(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)染色是肾穿刺活检术中重要的染色方法之一，主要检测肾脏组织中糖元和其它多糖物质，显示肾小球系膜区的范围和基膜的厚度、肾小球内某些渗出性蛋白、节段性硬化和结节性病灶等[1]。Schiff液是PAS染色的主要试剂成分，由于肾脏病理切片厚度为1-2 μm，较其他常规切片组织薄，着色相对困难，Schiff液存放时间稍久，其与肾脏组织糖类物质着色能力下降，给临床诊断造成一定的困难。为此笔者从2010年起，经历了1134例肾穿刺组织染色的摸索，改良了Schiff染液的配方，并将该配方与国内传统配方的染色效果进行对比，认为改良冷配Schiff染液法有更好的应用效果，不仅缩短PAS染色时间，同时也保证肾脏组织糖类物质有效表达，满足肾脏组织中糖类物质定性和定量检测的需要。

1 材料与方法

1.1仪器与药品

仪器：磁力搅拌器，电子天平；药品：碱性品红，N盐酸，偏重亚硫酸钠，蒸馏水，活性炭。

1.2染液配制方法

1.2.1 Schiff染液的传统热配法 称取碱性品红1 g加入刚煮沸的盛有200 ml蒸馏水的三角烧瓶中，摇动数分钟使之彻底溶解，冷却至50℃后过滤，加入1N盐酸20 ml，再冷至25℃时，加入1-1.5 g偏重亚硫酸钠，密封三角烧瓶口振荡器震荡使之全部溶解，于暗处静置24 h后变成稻草色，加入活性碳1-1.5 g，振摇1-2 min，过滤至无色透明，置于0-4℃避光保存[2]。

1.2.2 Schiff染液的传统冷配法 称取碱性品红1 g入蒸馏水400 ml,用磁力搅拌器搅拌2.5-3 h至完全溶解，继续加入1N盐酸40ml搅拌至暗红色,再加入偏重亚硫酸钠3 g，搅拌2.5-3 h至草黄色，然后室温下静置12 h，加入1 g活性炭，搅拌1 min后过滤至无色透明，置于0-4℃避光保存。

1.2.3 Schiff染液的改良冷配法 称取碱性品红6 g入蒸馏水420 ml，用磁力搅拌器搅拌2.5-3 h至完全溶解，继续加入1N盐酸80 ml和偏重亚硫酸钠10 g混合，搅拌2.5-3 h至草黄色，黑暗室温静置12 h后再加入5 g活性炭，搅拌后过滤至无色透明，置于0-4℃避光保存。

1.3PAS染色方法

(1)1134例蜡块切片厚度为1 μm，肾脏病理切片常规脱蜡至水；(2)1%高碘酸氧化10-15 min，流水冲洗1 min；(3)Schiff染液避光滴染后，流水冲洗5 min；(4)Harri 明矾苏木素液染核3-5 min，流水冲洗2 min；(5)1%盐酸乙醇分化10 s左右，流水冲洗2 min，弱氨水返蓝10 s左右，流水冲洗2 min；(5)系列乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

2 结果

2.1 相同环境和时间条件下，应用3种不同方法配制的Schiff液所染的肾组织PAS染色如图1，对肾组织的肾小球和肾小管基底膜、细胞浆、肾小球系膜基质、胶原纤维、血管及血管玻璃样变等部位着色鲜艳程度和阳性部位清晰程度对比发现：应用改良冷配法Schiff液染的PAS染色糖元和其它多糖物质着色力强，颜色鲜艳，背景清晰，与阴性成分区分明显，定位准确。即改良冷配法(图1A)优于传统热配法(图1B)和传统冷配法(图1C)。

2.2 在PAS染色过程中应用改良冷配法的肾组织标本完全着色耗时约为5-10 min，传统热配法的肾组织标本完全着色耗时约为20-40 min，传统冷配法的肾组织标本完全着色耗时约为30-60 min，改良冷配法肾组织标本完全着色时间明显少于传统热配法和传统冷配法。如图2，改良冷配法(图2D)的肾组织标本阳性部位比传统热配法(图2E)和传统冷配法(图2F)着色力强、定位准确，并且提高染色效率，保证Schiff染液与糖原充分反应。

A：改良冷配法；B：传统热配法；C：传统冷配法

D：改良冷配法；E：传统热配法；F：传统冷配法

2.3 改良冷配法无需加热，操作简单，节约时间，避免温度和时间掌控不准确而影响配制效果；传统冷配法配制耗时略少于改良冷配法，但肾组织标本完全着色耗时较长，阳性部位颜色与背景色区分不清晰，影响工作效率；传统热配法配制耗时长，温度要求较严，稳定性较差，复用效果不佳，冷却后易析出杂质(见表1)；随着储存时间延长，改良冷配法Schiff液着色能力和时间没有明显变化，而传统冷配法和传统热配法着色能力下降明显，组织染色较淡，染色时间变长，如图3，同一时间分别用改良冷配法(图3G)、传统热配法(图3H)和传统冷配法(图3I)配制的Schiff液六个月后所染的肾组织情况比较。

表1 Schiff染液的配制方法比较

G：改良冷配法；H：传统热配法；I：传统冷配法条件

3 讨论

改良冷配法与传统冷配法是在室温下采用振荡或搅拌的方法来增加分子之间的碰撞，促进染料的溶解与脱色，传统热配法通过加热促进分子的布朗运动进而加速染料的溶解与脱色，二者作用机制相同[3]。肾脏病理检查具有特殊性，为了能更好显示肾脏病理变化，要求切片厚度为1 μm左右，切片较薄容易致使肾脏组织切片着色困难，同时PAS染色颜色反应的深浅取决于乙二醛基多寡，因此为了能够充分氧化多糖的乙二醇基变为乙二醛基，本实验采用氧化剂为1%高碘酸(HIO4)，组织中氧化生成的醛基与Schiff试剂结合后即呈现出紫红色反应产物而得到定位[4]。Schiff染液随着储存时间延长部分偏重亚硫酸钠会被消耗掉，碱性品红与亚硫酸盐结合成不稳定的无色物质转化为二氧化硫逸出，致使着色能力逐渐下降[5]，为了避免此种弊端，改良冷配法分别将偏重亚硫酸钠和碱性品红的浓度提高到0.02 g/ml、0.012 g/ml。

经过长时间的验证，改良冷配Schiff染液较传统热配法和传统冷配法使用周期长、染色时间短、试剂稳定性好、无杂质。改良冷配法Schiff染液着色能力较强，较好地显示肾小球毛细血管和肾小管的破坏、皱缩、增厚程度；肾小球系膜细胞及基质增生的情况；高血压病细动脉壁内沉积的蛋白质和玻璃样变；各种炎性细胞浸润程度等，与阴性成分区分明显、定位准确，并且在染色的过程中不会出现沉渣。

在工作中为保证PAS染色效果，Schiff液4℃冰箱内冷贮备用，使用之前45 min取出恢复至室温；避免Schiff液与空气接触，以防氧化变色；Schiff液配制和染色过程中所用的玻璃器皿须干燥、清洁，因无色碱性品红液遇自来水则变红色[6]。

综上所述，改良冷配Schiff染液法较传统热配法和传统冷配法更适合肾穿刺活检组织切片的PAS染色，有助于临床病理诊断，值得推广应用。

作者简介：娄岩(1985-)，男，硕士学位，技师，主要从事肾脏病理研究。

参考文献：

[1]汪 伟，张 萍，邹玉蓉，等．PB-FA固定液固定肾组织作高碘酸-希夫染色的探讨[J]．实用医技杂志，2010，17(1)：80．

[2]陈啸梅，周文郁，彭俊云，等．组织化学手册[M]．北京：人民卫生出版社，1982：52．

[3]胥维勇，杨 群．4种Schiff试剂冷配法的应用和体会[J]．诊断病理学杂志，2003，10(1)：49．

[4]孙 璟，杨剑辉．肾活检用 Schiff 试剂的配制及保存[J]．实用医药杂志，2011，28 (12)：1067．

[5]周展眉，杨 芳，曹 维．Schiff 改良热配方与常见3种配方用于肾脏病理染色的效果比较[J]．南方医科大学学报，2012，32(3)：371．

[6]田玉旺，李 琳，朱红艳，等．失效Schiff液的再利用[J]．诊断病理学杂志，2009，16(5)：390．