CCL20在人体炎症牙髓表达的免疫组化研究

张志鹰,张志民,闫胜男，翟利云

(吉林大学口腔医院 牙体牙髓病科，长春130021)

牙髓炎是人体常见的口腔疾病，是由于细菌(主要为G-菌)入侵牙本质包绕的牙髓而引起的一种炎症反应[1]。趋化因子是一类指导白细胞移行到炎症感染部位，由多种细胞产生，可诱导的一类低分子量的(多为8-10 kD)分泌蛋白，在炎症反应中具有重要作用[2]。CCL20，CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20)，依据2000年公布的新的命名法则命名[3]，曾称巨噬细胞炎症蛋白-3α，由1997年被Rossi等首次利用生物学技术鉴定发现。CCL20是趋化因子CC家族中的重要一员，由多种细胞产生，CCL20是一类对多种细胞如未成熟DC、单核细胞或T淋巴细胞具有明显趋化作用的细胞因子，对人体的免疫反应和炎症反应都有密切的关系，其唯一的受体是趋化因子受体6(chemokine receptor6,CCR6)[4,5]。在炎症疾病中，CCL20的主要功能是趋化未成熟的效应T细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等，对球菌和G-杆菌有较强的抗菌活性，是一种天然的抗菌蛋白。目前，已有学者研究了CCL20及其受体CCR6的表达变化在乳腺癌、宫颈病变、牛皮癣发病机制中的作用[6-8]，以及其在支气管哮喘发病中的作用机制[9]。牙髓疾病一般是由细菌侵袭牙髓牙本质复合体，引起牙髓组织发生炎症反应，与体内其它部位相似，目前，并无CCL20与牙髓炎症疾病相关的报道，其在牙髓疾病中的发生、发展的作用机理也尚不清楚。本实验采用免疫组织化学检测法，检测人体正常、慢性及急性炎症中CCL20在牙髓组织中的表达，初步揭示CCL20是否参与牙髓炎症的应答反应，为进一步探讨CCL20在牙髓损伤修复中的具体调控作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验标本与主要试剂

实验所用标本来源由吉林大学口腔医学院2013年2月-10月接受口腔牙体牙髓科及口腔正畸科治疗的患者自愿提供。急性牙髓炎组(AP)，慢性牙髓炎组(CP)，正常牙髓组(NS)各20例(正畸科取无龋坏，无牙周病，无牙髓炎症的正常牙)，患者年龄16-65岁之间。所用标本全部选用无关节炎病史及全身系统性疾病史，并且为两个月内未服用免疫抑制剂及抗菌药物，之前未做过牙髓治疗的标本。1抗：Rabbit Anti-CCl20 antibody(bs-1268R) ；2抗：SP Kit(Broad Spectrum) (SP-0022)；DAB显色剂；PBS；柠檬酸修复液；抗体稀释液

1.2 实验方法

1.2.1 牙髓组织切片 取临床上慢性，急性牙髓炎及正畸患者的牙髓组织，拔出后立即置入40 g/L多聚甲醛中，4℃恒温固定24 h后，根据不同的牙髓组织症状，分为3组(急性炎症组，慢性炎症组，正常对照组),每组20例，再次恒温4℃固定，固定时间为24 h，牙髓组织常规脱水后石蜡包埋，做成5 μm厚度的切片。将3组标本共60例逐个进行HE染色后免疫组化染色并在光学显微镜下观察。使用HE染色结果来当作病理学分组标准进而区分个组标本。

1.2.2 免疫组化染色 石蜡切片常规脱水至水化，PBS冲洗5 min,3次，高温修复抗原(沸水浴修复15 min，自然凉至室温，PBS冲洗5 min,3次，正常山羊血清封闭，37℃20 min，一抗孵育(比例1∶100)，4℃过夜，滴加生物素标记的第二抗体(羊抗兔IgG)37℃20 min，辣根酶标记的链酶亲和素(三抗)，37℃20 min,DAB显色，苏木精复染，脱水透明后中性树胶封片，以PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察人炎症牙髓组织中CCL20的表达

1.2.3 结果判定 阳性细胞的判定特征：细胞膜、细胞质呈现黄色，可见棕黄色染色颗粒。阳性细胞率计算方法：在400倍光学显微镜下，从每个标本随机选取4个视野，查取各个视野下CCL20阳性细胞数，同时查取整个视野细胞总数，按照公式：阳性细胞%=阳性细胞数/细胞总数×100%计算各个视野下阳性细胞比例，求4个视野下阳性细胞比例的平均值，即为阳性细胞率。

1.2.4 统计学分析 使用统计软件SPSS19.0做方差分析，通过Q检验比较每两组间CCL20阳性细胞率的差异性，当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镜下所见

2.1.1 健康牙髓组 镜下可见大量的组织细胞、成纤维细胞，散在T细胞、树突状细胞，未见B细胞。其中T细胞主要分布在牙髓边缘区域。T细胞和树突状细胞的细胞膜、细胞质未见黄染，无棕黄色颗粒，即CCL20无表达(如图1)。

2.1.2 炎症牙髓组 不用牙髓标本及同一切片的不同区域阳性细胞密度明显不同。镜下可见慢性牙髓炎组黄染程度明显强于急性牙髓炎组(如图2、3)。

镜下可见炎症牙髓中有大量T细胞、B细胞浸润，树突状细胞增加并聚集。炎症细胞主要分布于病变区域，其中急性组中T细胞浸润少于慢性组，两组之间B细胞浸润无明显差异。在炎症细胞浸润区域可见B细胞、T细胞、树突状细胞的细胞膜、细胞质呈不同程度的黄染，其中细胞质染色较浅同时可见棕黄色颗粒(如图4、5、6)。

图1健康牙髓组，×200图2炎症牙髓组(慢性)，×200图3炎症牙髓组(急性)，×200

图4CCL20在炎症牙髓树突状细胞中的表达，×200图5CCL20在炎症牙髓T细胞中的表达，×200图6CCL20在炎症牙髓B细胞中的表达，×200

2.2 统计学分析

CCL20的阳性细胞率统计分析如表1所示， 3组标本CCL20的阳性细胞表达率有显著性差异(P<0.05)。

表1 各组牙髓标本中CCL20阳性细胞表达率(%)

3 讨论

CCL20属趋化因子CC亚族，相对分子质量为9000[10]，基因定位于2q35-36，包括4个外显子和3个内含子[11-13]。CCL20可在不同因素刺激下由多种细胞分泌产生，包括成纤维细胞、树突状细胞、记忆T细胞，及某些肿瘤细胞[14]。CCR6为CCL20的唯一受体，可与CCL20特异性结合，主要表达于记忆T细胞、未成熟树突状细胞、B细胞以及淋巴细胞。CCL20的生物学特性复杂，主要包括以下几个方面：①CCL20与其受体CCR6相互作用控制B细胞的分化、发育。趋化未成熟树突状细胞向炎症部位迁移，活化单核巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞；②增强T淋巴细胞、单核细胞迁移能力，促进其与内皮细胞的黏附；③趋化B细胞，并刺激活化B细胞产生多种免疫球蛋白等。

牙髓组织炎症是由宿主对病原体发生的免疫反应造成的，包括非特异性炎症反应和特异性免疫反应。当牙髓组织即便是牙本质小管中，受到病原体如变形链球菌、革兰阴性厌氧菌、普沃雷菌等入侵时都会发生炎性变化。炎性变化的组织部位有大量的巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞存在，炎性变化部位的局部还存在一些免疫球蛋白，主要为IgG。牙髓组织发生炎症反应时，既有多种免疫球蛋白如IgG、IgA、IgE、IgM等存在，又有淋巴细胞、多种T细胞及其介质参与的免疫反应存在，所以体液免疫和细胞免疫在牙髓组织炎症过程中均发挥着重要的作用。

本实验采用免疫细胞化学技术首次检测人体炎症牙髓组织中CCL20的表达。结果显示，CCL20主要在牙髓组织细胞的细胞浆内表达，细胞膜、细胞核多不表达。并且在人体炎症牙髓组织中CCL20 表达较高，而正常牙髓组织CCL20基本不表达，当牙髓组织受到细菌、致炎因子、细菌分泌的代谢产物等侵袭时，CCL20的表达明显增加，说明CCL20参与了牙髓炎症反应，当人体牙髓组织自身的防御能力过弱或者病原体的刺激过强时，在病原体的不断刺激下，中性粒细胞、单核巨噬细胞、活化T细胞等细胞会分泌多种炎症细胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，也会增加CCL20在组织中的表达，而趋化因子CCL20的上调表达又会活化并趋化树突状细胞、中性粒细胞、T细胞等细胞向病损部位迁移，并刺激B细胞产生多种免疫球蛋白如IgG、IgA、IgE等,在此防御过程中，不可避免地会造成组织的损伤与破坏。由此推测趋化因子CCL20在牙髓组织炎症状态下可能具有致炎作用，CCL20通过上调表达调动了机体的炎症免疫应答水平。

综上可以确定，牙髓组织炎症反应与CCL20的表达存在一定的相关性，由于趋化因子CCL20以及其受体CCR6作用网络及在炎症时牙髓组织免疫反应机制的复杂性，CCL20在牙髓组织免疫应答时具体的调控作用以及与其他牙髓组织中的趋化因子、制炎因子的相关联系还有待深入的研究。

参考文献：

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