RAPD技术筛选麦冬分子鉴定标记的研究

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(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

中药麦冬为百合科多年生草本植物麦冬(Ophiopogonisjaponicus)的干燥块根，具有养阴生津，润肺清心的功效，在临床上应用广泛.我国药典规定药用麦冬主要品种包括湖北麦冬、川麦冬和浙麦冬.其中，浙麦冬和川麦冬同属于百合科沿阶草属，湖北麦冬则属于百合科山麦冬属.湖北麦冬主产于湖北襄樊，由于生长周期短，产量高，成为了麦冬的主流品种.川麦冬主产于绵阳三台，与湖北麦冬并列为国家地理标志性产品.浙麦冬又称杭麦冬、笕麦冬，属“浙八味”之一，是著名的道地药材.由于湖北麦冬、川麦冬和浙麦冬的外观性状及理化性质都极为相似，很难用性状鉴定，显微鉴定和理化检测等传统鉴定方法将三者区分开来.

近年来，分子生物学技术已经被广泛运用于中药鉴定，随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)是在1990年Williams[1]和Welsh[2-3]领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新的DNA分子标记技术.它是建立在PCR基础之上，可直接分析药用植物DNA的多态性，并能筛选特有的DNA标记.RAPD技术具有操作简便，耗时短等优点，在中药材的分子鉴定研究领域中得到了广泛的运用[4-6].采用RAPD技术对湖北麦冬、川麦冬及浙麦冬三种药用麦冬的基因组DNA进行多态性分析，从而筛选出三种麦冬的特异性分子鉴定标记，为建立一套高效、准确的麦冬鉴定方法奠定基础，对实现中药材麦冬的分子鉴定具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 药 材

中药湖北麦冬植株购自湖北襄樊市欧庙镇；中药川麦冬植株购自著名麦冬生产基地四川省绵阳市三台县；中药浙麦冬植株采自浙江宁波余姚和慈溪天元镇.以上样品按照文献[7-8]所述方法经鉴定均为正品.

1.1.2 实验试剂与仪器

植物基因组DNA快速抽提试剂盒和PCR相关试剂购自生工®生物工程(上海)有限公司.RAPD引物由生工®生物工程(上海)有限公司合成.实验使用的PCR扩增仪MyCycle® Thermal Cycler，电泳仪Power PacTMBasic，凝胶成像系统Molecular Imager® Gel DocTMXR+Imaging System，均为Bio-Rad公司产品.

1.2 实验方法

1.2.1 麦冬基因组DNA的提取

称取100 mg麦冬植株的新鲜嫩叶，剪碎放入研钵中，倒入液氮快速研磨成粉末，将粉末移入1.5 mL离心管中依次加入400 μL Buffer PCL Solution，8 μL β-巯基乙醇,震荡混匀.65 ℃水浴45 min至细胞完全裂解，加入20 μL RNase A放置5 min，然后加入200 μL Buffer PP Solution，充分颠倒混匀后-20 ℃静置5 min，室温10 000 r/min离心5 min，将上清液移到新的1.5 mL离心管中；加入等体积的异丙醇(-20 ℃预冷)，颠倒混匀置于4 ℃过夜，10 000 r/min离心5 min，弃上清；加入1 mL 75%乙醇漂洗，10 000 r/min离心2 min，弃上清，重复此步骤一次；开盖倒置10 min至残留的乙醇完全挥发.提取获得的基因组DNA用80 μL TE Buffer溶解，于-20 ℃储存备用.

1.2.2 麦冬基因组DNA的质量检测

电泳法检测麦冬基因组DNA的质量：制备1%的琼脂糖凝胶，样品与上样液混合后加入加样孔中，在电压75 V的条件下电泳50 min，胶板经0.5 μg/mL溴化乙锭溶液染色后，移至凝胶成像系统，在紫外环境下观察，检测结果拍照留存.分光光度法检测麦冬基因组DNA的质量：将湖北麦冬、川麦冬和浙麦冬基因组DNA进行适量稀释，以TE溶液为空白对照，测定各麦冬样品的OD260值和OD280值，计算OD260/OD280值以评估基因组DNA的纯度.根据公式DNA质量浓度=OD260×稀释倍数×50，可计算出各样品的DNA质量浓度.

1.2.3 RAPD引物的合成

根据引物中GC百分比(%)较高，无发卡结构的原则，从RAPD引物库中选取了40条引物，均由10个碱基组成，送至上海生工生物工程有限公司合成.RAPD引物序列见表1.

表1 RAPD引物序列

1.2.4 RAPD反应体系的优化

RAPD反应的初始体系为：2 μL 10×PCR buffer(without MgCl2)，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.5 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)，1 μL RAPD引物(20 μmol/L)，1 μL麦冬基因组DNA模板，补 ddH2O至反应液总体积为20 μL.初始RAPD扩增条件为：94 ℃预变性3 min，然后每个循环：94 ℃变性15 s，36 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，45个循环，最后72 ℃延伸7 min.

根据本实验室对RAPD扩增的研究经验[9]，模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及退火温度对RAPD扩增起到关键性作用.为了获得RAPD扩增的最佳效果，本实验依次对模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及退火温度进行了优化，优化参数见表2.在优化过程中，每次只调节一个单因素的量，其他因素维持在初始体系的浓度，在确立了最佳模板DNA浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶后再对退火温度进行优化，完善扩增程序，得出最佳的RAPD反应体系，从而确保RAPD扩增的稳定性.

表2 RAPD反应体系优化实验的影响因素

1.2.5 麦冬分子鉴定标记的筛选

以湖北麦冬、川麦冬和浙麦冬基因组DNA为模板，逐一以40条随机引物为扩增引物，根据优化后的RAPD最佳反应条件进行扩增.RAPD扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，胶板经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统中观察结果，并照相留存.

2 结果与分析

2.1 麦冬基因组DNA的提取和质量分析

三种麦冬基因组DNA的提取结果(图1)显示各麦冬基因组DNA大小在23 kb左右，DNA条带清晰明亮，无弥散现象，点样孔内无残留，说明提取到的三种麦冬基因组DNA完整无降解，蛋白质及多糖类杂质较少，质量较好，浓度较高.根据图1中条带的亮度，确定三种麦冬基因组DNA紫外分光光度法检测的稀释倍数.稀释的样品在紫外分光光度计上检测后的结果见表3，三种麦冬基因组DNA的OD260/OD280比值在1.804～1.907之间，DNA浓度介于351～736 μg/mL.紫外分光光度计检测的数据亦表明三种麦冬基因组DNA的纯度和浓度均较高，蛋白质杂质较少.

M—DNA分子量Marker；1—湖北麦冬新鲜嫩叶DNA提取物；2—川麦冬新鲜嫩叶DNA提取物；3—浙麦冬新鲜嫩叶DNA提取物

表3 麦冬基因组DNA的紫外检测结果

高质量的基因组DNA作为RAPD反应的模板，是筛选分子鉴定标记的关键.其中DNA的来源组织很重要，从新鲜嫩叶中提取DNA可以充分保证DNA的质量.由于嫩叶组织中的细胞生长旺盛，DNA分裂快，DNA含量就高；并且由于是新生组织，次级代谢产物如蛋白质和多糖等杂质的含量都会是最低的.本实验以新鲜嫩叶为提取组织，提取到了高质量的DNA，以保证后续实验的顺利进行.

2.2 RAPD最佳反应体系的建立

本实验室在预实验中发现以浙麦冬基因组DNA为模板，S430为引物的RAPD图谱条带较丰富且清晰，因此以此反应为研究对象进行RAPD优化实验.优化实验结果见图2，3，根据图示结果选择最佳的反应条件.图2(a)结果显示：当模板DNA浓度低于1.0 μL时，无扩增条带出现；高于1.0 μL时，扩增条带出现弥散现象，因此设定1.0 μL为最佳DNA模板量.图2(b)结果显示：当引物浓度高于0.7 μmol/L时，扩增条带出现弥散现象；当引物浓度低于0.3 μmol/L时，无扩增条带或者条带不清晰，因此设定0.5 μmol/L为最佳引物浓度.图3(a)结果显示：当Taq DNA聚合酶低于1.0 U时，无扩增条带出现；高于2.0 U时，扩增条带出现弥散现象，因此设定1.5 U为最佳Taq DNA聚合酶.图3(b)结果显示：退火温度为40 ℃时，扩增条带数目多且清晰，因此设定用40 ℃为最佳退火温度.

M—DNA分子量Marker；1—5模板DNA体积0.5，0.8，1.0，1.2，1.4 μL;6—10引物浓度1.0，0.7，0.5，0.3，0.1 μmol/L

M—DNA分子量Marker；1—5 Taq DNA聚合酶 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 U;6—10退火温度34，36，38，40，42 ℃

通过对影响RAPD扩增反应的关键因素进行优化，确定最佳的RAPD反应体系为：2 μL 10×PCR buffer(without MgCl2)，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.3 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)，0.5 μL RAPD引物(20 μmol/L)，1 μL麦冬基因组DNA模板，补ddH2O至反应液总体积为20 μL.最佳的RAPD扩增程序为：94 ℃预变性3 min，然后每个循环：94 ℃变性15 s，40 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，45个循环，最后72 ℃延伸7 min.

RAPD具有耗时短、操作方便等优点，但也存在局限性，体现在使用随机引物，以及退火温度低引起的实验结果重复性差.通过对RAPD条件进行优化，能够使RAPD在本实验室的操作环境下保持最高程度的稳定性，以利于麦冬分子鉴定标记的筛选和回收.

2.3 麦冬分子鉴定标记的筛选

以湖北麦冬、川麦冬和浙麦冬基因组DNA为模板，逐一使用40条随机引物进行RAPD扩增，进行三种麦冬分子鉴定标记的筛选.通过对40条引物结合下的40份RAPD扩增图谱的分析，共筛选到了6条分子鉴定标记(图4).这8条分子鉴定标记分子量大小适宜，均在500～2 000碱基之间，条带明亮清晰，利于回收.图4(a)是引物S86结合下的RAPD结果，箭头1所指的条带是浙麦冬分子鉴定标记；箭头2所指的条带是湖北麦冬分子鉴定标记.图4(b)是引物S65结合下的RAPD结果，箭头1所指的条带是湖北麦冬分子鉴定标记；箭头2所指的条带是川麦冬分子鉴定标记.图4(c)是引物S64结合下的RAPD结果，箭头1和2所指的条带均为湖北麦冬分子鉴定标记.图4(d)是引物S22结合下的RAPD结果，箭头1所指的条带为浙麦冬分子鉴定标记.图4(e)是引物S20结合下的RAPD结果，箭头1所指的条带为川麦冬分子鉴定标记.4条湖北麦冬标记代表不同的基因序列，由于回收分子标记过程中DNA会损失，分子标记的回收和克隆是否成功存在一定的不可预计性，因此，收获的分子鉴定标记越多越好.从图4可以看出：每个分子鉴定标记只在一种麦冬中出现，而其他品种都不会出现，回收这些分子鉴定标记，并进行测序就可以获得分子鉴定标记的序列，这些序列具有特异性，可以根据序列设计特异性引物，进而实现三种麦冬的特异性PCR鉴定.

对3种麦冬分子鉴定标记的筛选发现湖北麦冬分子鉴定标记数目较多，收获的8条分子鉴定标记中湖北麦冬占到了4条，浙麦冬和川麦冬各占2条.这说明湖北麦冬的基因组成与川麦冬和浙麦冬的差异显著，川麦冬和浙麦冬的基因构成则较为相似.从物种亲缘性分析，浙麦冬和川麦冬是同属于沿阶草属的，而湖北麦冬则属于山麦冬属.所以，分子鉴定标记筛选的实验结果也间接体现了3个麦冬品种亲缘性的远近.目前，筛选获得的8条分子鉴定标记的回收、克隆、测序工作正在进行中.

3 结 论

RAPD技术具有操作简便的优点，已经成为一种常用的中药分子鉴定技术，但由于该技术稳定性和重复性差，应用受到了很大的制约.本实验从麦冬嫩芽组织中提取到了高质量的基因组DNA，并对RAPD反应条件进行了优化，最大程度确保了RAPD扩增的稳定性.通过对湖北麦冬、川麦冬和浙麦冬3个品种麦冬基因组DNA的RAPD分析，筛选获得了8条麦冬分子鉴定标记，其中川麦冬和浙麦冬各2条，湖北麦冬4条.将这些标志着麦冬特异性序列的分子标记进行回收、克隆和测序，可以根据测序结果设计引物，实现三种麦冬的特异性PCR鉴定，这种鉴定方法准确，灵敏，重复性好，适用性广，具有良好的应用前景.

M—DNA分子量Marker；1—川麦冬基因组DNA模板；2—湖北麦冬基因组DNA模板；3—浙麦冬基因组DNA模板

参考文献：

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