2型糖尿病性勃起功能障碍大鼠模型的建立及氧化应激对海绵体组织内nNOS表达的影响

孔东波，查文良，郭宗华，江波涛

(咸宁市中心医院泌尿外科，湖北 咸宁 437100)

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是指多种原因造成的阴茎海绵体血液充盈不足，致阴茎持续不能达到和/或维持足够的勃起，以完成并维持满意的性交，病程超过3个月就可诊断为ED。近年来我国居民生活水平得到显著的提高，饮食结构和生活方式也发生明显的改变，因此2型糖尿病患者数量也急剧增加。作为糖尿病严重并发症之一的ED，引起国内外学者广泛的关注。大约35%～75%糖尿病男性患者患有ED[1]。以往文献报道，2型糖尿病各种并发症的发生、发展与氧化应激有着密切的关系，神经型一氧化氮合酶(nNOS)在阴茎勃起的过程中起到重要作用。本研究通过建立2型糖尿病大鼠模型，探讨氧化应激与nNOS在2型糖尿病性ED发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验药品、试剂与仪器 兔抗鼠nNOS抗体、山羊抗兔二抗试剂盒购自Sigma公司；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)；阿扑吗啡(apomorphin，APO，Sigma)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒购自北京天恩泽有限公司；胰岛素放免试剂盒购自上海瑞齐生物科技有限公司。

1.2 实验动物 10周龄SPF级白色雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体质量220g左右，购自武汉大学医学院实验动物中心，交配实验证实勃起功能正常。

1.3 建立2型糖尿病大鼠模型与APO实验检测勃起功能 实验开始前40只大鼠适应性喂养1周，随机选取30只做为实验组，剩下的10只作为对照组(大鼠未被行特殊处理)。实验组给予高脂高糖饮食且不限水，半天光照、半天黑暗条件下喂养4周。3d内2次尾静脉注射STZ，1周称重后，按照5.0g/kg给每只大鼠用50%葡萄糖水灌胃，测定胰岛素抵抗指数。2型糖尿病大鼠造模成功的标准为：空腹血糖>16.7mmol/L且具有胰岛素抵抗。糖尿病大鼠造模成功后继续被给予高脂高糖饮食8周且每周测1次空腹血糖观察一般状况。

阿朴吗啡(APO)试验：两组大鼠饲养8周后称重，将每只大鼠放到透明玻璃箱中，室内保持安静，灯光调暗至仅够观察，适应环境15min，然后在大鼠颈部皮肤下注射阿朴吗啡100μg/kg，观察30min，并记录每组大鼠阴茎勃起次数。阴茎膨大、包皮后退，龟头充血及末端阴茎露出即为1次阴茎勃起。勃起次数≥1次，认为是勃起实验阳性。

1.4 标本的处理、分光光度法测定MDA、SOD及Western Blotting技术检测阴茎组织中nNOS的表达 阿朴吗啡试验结束后，继续禁食不禁水12h，将大鼠处死，立即分离出阴茎组织，用生理盐水冲洗后，迅速置于-80℃超低温冰箱中，检测阴茎海绵体组织中超氧化丙二醛(MDA)、物歧化酶(SOD)的含量和用Western Blotting技术检测阴茎组织中nNOS的表达情况。

2 结 果

2.1 2型糖尿病性勃起功能障碍大鼠模型建立与APO实验 实验组大鼠尾静脉注射STZ并高脂高糖饮食后开始出现多饮、多食、多尿，形体消瘦。对照组大鼠食欲正常，活动有力。到全部实验结束时，对照组大鼠未有死亡，实验组大鼠有25只2型糖尿病造模成功，有6只在实验期间死于各种糖尿病并发症。尾静脉注射STZ，1周后所测空腹血糖、空腹胰岛素及计算胰岛素抵抗指数见表1。

表1 两组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素及计算胰岛素抵抗指数

阿朴吗啡实验：10只对照组大鼠阴茎都可以勃起，勃起率为100%。最后存活19只2型糖尿病大鼠中，只有7只可以勃起，勃起率为37%。将可以勃起的7只糖尿病大鼠从实验组剔除。

2.2 分光光度法测定MDA与SOD 结果见表2。

表2 对照组和实验组大鼠阴茎组织中的MDA、SOD含量

2.3 nNOS在两组大鼠阴茎海绵体组织内的表达情况 由图1可知实验组大鼠阴茎海绵体组织中nNOS的表达量明显低于对照组大鼠阴茎海绵体组织中的nNOS。

图1 Western Bloting法检测大鼠阴茎海绵体组织内nNOS表达量

3 讨 论

目前糖尿病的发病率正在快速地升高，应用在治疗糖尿病的花费也非常的高昂[2]。在美国有多于800万糖尿病性ED患者[3]。专家们推测随着糖尿病发病率的增加，糖尿病性勃起功能障碍的发病率也会大大的增加。在美国每年用在治疗勃起功能障碍的直接花费大约4亿美元，其中大约1亿美元是用于治疗糖尿病性勃起功能障碍[3]。药物治疗糖尿病性勃起功能障碍的有效率非常低，并且药物不能阻止和/或逆转糖尿病性勃起功能障碍病程的进展。研究对象是1型糖尿病，对于2型糖尿病性勃起功能障碍机制的研究还比较少[4]。更为重要的是目前缺乏对于2型糖尿病勃起功能障碍男性患者长期的观察研究，用于研究2型糖尿病勃起功能障碍机制的动物模型也是最近几年来才得到学者们的重视。因为在男性糖尿病患者中非胰岛素依赖性2型糖尿病患者占90%～95%。但是绝大多数的基础实验研究集中在以1型糖尿病动物模型为研究对象的勃起功能障碍发生机制的研究[5]。迄今为止，大约只有十多个研究是以2型糖尿病动物模型为研究对象。2型糖尿病动物模型的建立大多数选取鼠类，包括肥胖的ZDF大鼠、BBZ/WOR大鼠、OLET大鼠[6]。小鼠模型通常也可以被用来研究，包括高脂饮食的肥胖糖尿病Tsumara Suzuki小鼠、新西兰肥胖ob/ob与db/db小鼠[7]，其中后两种小鼠对减肥药如来普汀缺乏敏感性。这些动物模型与人类2型糖尿病症状相似通常同时具有高血糖、胰岛素抵抗、高脂血症、肥胖的特点。但是，这些动物模型中只有少数几种出现勃起功能障碍并可应用于勃起功能障碍的研究。特别是对阴茎组织内脂肪过多介导的勃起功能障碍机制的基础研究表明，α-肿瘤坏死因子在勃起功能障碍的发生发展中起到重要的作用[8]。但是这些实验研究采用的动物模型是昂贵的遗传性2型糖尿病大鼠模型，这些动物模型有两大缺点：①价格昂贵不利于大样本的实验研究；②不能正常反应自然病程的所有方面特征[9]。我们采用的高脂高糖饮食联合低剂量注射STZ方法造成的糖尿病性勃起功能障碍大鼠形体消瘦，这点与2型糖尿病性ED患者形体消瘦相似。在全世界范围内非肥胖性2型糖尿病患者占所有2型糖尿病患者的42%，在我们中国绝大多数都是非肥胖性2型糖尿病患者[10]。

在阴茎勃起过程中NO是起决定作用的神经递质，而NO合酶是催化 L-精氨酸分解产生NO的关键酶。NO合酶是一种含有亚铁血红蛋白的合酶，是由两个亚单位组成的具有催化活性的同源二聚体，分子量约为150000KD。NO合酶是NO合成的限速酶，哺乳动物细胞内有3种亚型的NO合酶：神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。在阴茎海绵体内与NO的生成关系最为密切的是nNOS和eNOS。海绵体组织中由nNOS催化合成的NO在阴茎勃起中起着“扳机”作用[11]。当机体受到性刺激时，阴茎组织中nNOS被激活短暂释放少量的NO引起阴茎脉管系统和海绵窦中平滑肌舒张导致阴茎动脉血流增加、体积膨大而启动阴茎勃起。血流对阴茎脉管系统和海绵窦血管内皮细胞产生的应切力激活PI3-K/Akt/eNOS信号通路，使eNOS(Ser-1177)位点发生磷酸化，引起NO持续的释放，从而使阴茎组织内的平滑肌持续的舒张，阴茎达到完全的勃起[12]。

氧化应激损伤是指机体内高活性分子如活性氧簇(ROS)产生过多和/或消除减少而导致的组织损伤。氧化应激产生的自由基可以与DNA、蛋白质和多不饱和脂肪酸作用，造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白-蛋白交联、蛋白-DNA交联及脂质过氧化。此外，自由基也极易与其它物质发生反应形成新的自由基或氧化物。我们的实验结果发现：与对照组相比，2型糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体组织内的MDA含量显著增高，并且具有统计学意义(P<0.05)；而与对照组相比，2型糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体组织内SOD的活性显著的降低(P<0.05)。这的确说明了糖尿病时阴茎海绵体内ROS显著增加，机体抗氧化防御能力下降，使两者原先的平衡被打破，进一步引起勃起功能障碍。

低剂量STZ联合高脂高糖饮食可造成2型糖尿病动物模型。2型糖尿病可致成年雄性SD大鼠阴茎海绵体组织中MDA含量升高，SOD活性降低，发生氧化应激反应。2型糖尿病使得阴茎海绵体组织发生氧化应激损伤导致nNOS的表达降低可能是引起糖尿病性勃起功能障碍发病的重要病因之一。

[1]McCulloch DK，Campbell IW，Wu FC，et al.The prevalence of diabetic impotence[J].Diabetologia，1980，18(4):279

[2]Hogan P，Dall T，Nikolov P.Economic costs of diabetes in the US in 2002[J].Diabetes Care，2003，26(3):917

[3]Saigal CS，Wessells H，Pace J，et al.Predictors and prevalence of erectile dysfunction in a racially diverse population[J].Arch Intern Med，2006，166(2):207

[4]Chitaley K.Type 1 and type 2 diabetic-erectile dysfunction：same diagnosis (ICD-9)，different disease[J].J Sex Med，2009，3(6 suppl):262

[5] Bacon CG，Hu FB，Giovannucci E，et al.Association of type and duration of diabetes with erectile dysfunction in a large cohort of men[J].Diabetes Care 2002，25(8):1458

[6]Vernet D，Cai L，Garban H，et al.Reduction of penile nitric oxide synthase in diabetic BB/WORdp (type I)and BBZ/WORdp (type II)rats with erectile dysfunction[J].Endocrinology，1995，136(12):5709

[7]Xie D，Odronic SI，Wu F，et al.Mouse model of erectile dysfunction due to diet-induced diabetes mellitus[J].Urology，2007，70(1):196

[8]Carneiro FS，Zemse S，Giachini FR，et al.TNF-alpha infusion impairs corpora cavernosa reactivity[J].J Sex Med，2009，3(6 suppl):311

[9]Gur S，Kadowitz PJ，Hellstrom WJ.A critical appraisal of erectile function in animal models of diabetes mellitus[J].Int J Androl，2009，32(2):93

[10]Brunetti P.The lean patient with type 2 diabetes:characteristics and therapy challenge[J].Int J Clin Pract Suppl，2007，(153):3

[11]Zhang XH，Filippi S，Morelli A，etal.Testosterone restores diabetes-induced erectile dysfunction and sildenafil responsiveness in two distinct animal models of chemical diabetes[J].Sex Med，2006，3(2):253

[12]Hurt KJ，Musicki B，Palese MA，et al.Akt-dependent phosphorylation of endothelial nitric-oxide synthase mediates penile erection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(6):4061