辛伐他汀对糖尿病大鼠血脂和血小板膜糖蛋白表达水平的影响

杨薇 黎小妍 刘玉兴 张立建 钱兴国

糖尿病是心脑血管病的重要危险因素，血管病变是2型糖尿病的重要并发症，由于血小板活化异常导致高凝、微血栓形成，最终引起血管闭塞[1]。最近有研究表明，羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂(即他汀类药物)除了能降低血浆胆固醇水平外，还可以抑制血管平滑肌细胞增殖，稳定斑块，抑制血小板凝聚和血栓形成以及抗炎症反应[2]。因此，本研究观察了他汀类药物辛伐他汀对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠血小板膜糖蛋白水平的影响，探讨该类药物对糖尿病心脑血管并发症的保护作用。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

STZ由美国Sigma公司提供；辛伐他汀由默沙东中国有限公司生产，批号J20120012；总胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；FITC标记的大鼠CD61抗体， PerCP标记的大鼠CD63抗体，PE标记的大鼠CD41、CD62p抗体均购于美国PHARMINGEN公司；流式细胞仪为Coulter公司的EPICS ELITERESP型；采用德国罗氏血糖仪检测大鼠血糖。

二、动物和分组

50只雌性Wistar大鼠 (由广东省实验动物中心提供)，体质量200～250 g，适应性喂养1周后，随机取10只分为对照组，其余40只给予高脂饲料(正常饲料+10%甘油三酯+2%胆固醇)喂养，8周后，禁食12 h，单次腹腔注射55 mg/kg STZ(溶媒为0.1mmol/L无菌枸橼酸缓冲液)。1周后取尾静脉血测血糖，血糖大于16.7 mmol/L为糖尿病造模成功，成功后继续给予高脂饮食，对照组注射等量的枸橼酸缓冲液。共得造模成功高血糖大鼠24只，将其随机分成糖尿病组12只(死亡2只，最后为10只)；辛伐他汀组12只(死亡2只，最后为10只)，用辛伐他汀混悬液灌胃，20 mg/(kg·d)，共用12周。每周监测大鼠血糖，12周后处死大鼠检测血小板膜糖蛋白等各项指标。

三、观察指标

1.生化指标测定

喂养12周后处死大鼠，经颈动脉取血4 ml，高速离心后分离血清，用生化分析仪测定总胆固醇、甘油三酯、HDL和LDL，按试剂盒说明书的具体步骤进行操作。

2.血小板膜糖蛋白CD62p、CD63、CD41、CD61的测定

用流式细胞仪测定CD62p、CD63、CD41、CD61水平：抽取大鼠静脉血4 ml缓慢加入 3.8% 枸橼酸钠1∶9抗凝，混匀后1 200 r/min离心8 min。另取两只试管，抽取50 μl血小板混悬液分为4个试管，分别加入FITC标记CD61抗体，PerCP标记大鼠CD63，PE标记CD41、CD62p一抗，避光室温孵育30 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，加入二抗，室温孵育30 min，PBS洗脱，最后加入0.2 ml PBS混匀上机测定。

四、统计学处理

结 果

一、糖尿病、辛伐他汀及对照组血脂水平的比较

12周后糖尿病组大鼠血浆总胆固醇、甘油三酯和 LDL水平较对照组高，而HDL水平则较对照组低，比较差异有统计学意义(P<0.01)；辛伐他汀组总胆固醇、甘油三酯和 LDL水平较糖尿病组低，而HDL水平则较糖尿病组高(P<0.01)。见表1。

二、糖尿病、辛伐他汀及对照组血小板膜糖蛋白水平的比较

12周后糖尿病组血小板膜糖蛋白CD62p和CD63表达水平较对照组高，比较差异有统计学意义(P<0.01)；辛伐他汀组膜糖蛋白CD62p、CD63的表达水平较糖尿病组低(P<0.01)，与对照组比较则差异无统计学意义(P>0.05)。3组之间血小板膜糖蛋白CD61、CD41的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 糖尿病、辛伐他汀及对照组血脂水平比较

表2 各组大鼠血小板膜糖蛋白CD62p、CD63、CD61和CD41表达水平 (%)

讨 论

2型糖尿病的发病主要与胰岛素敏感性降低和胰岛素分泌障碍有关，其最主要的并发症是心脑血管病变，胰岛素抵抗或高胰岛素血症均可导致内皮细胞功能障碍，使纤溶活性、血小板凝集性增强，纤维蛋白原明显增多，导致动脉粥样硬化形成，同时大量细胞因子及受损的血管内皮细胞均可使血小板活化，聚集形成病理性血栓[3-4]。血小板在正常情况下是处于“静止”状态，但是当血管内皮损伤或处于某些病理状态时，血小板活化，血小板一旦被激活，其由通常的光盘形状改变成为球状，黏附至内皮细胞上，当相互黏附致过度聚集时，便导致血栓形成。血小板的黏附主要是由血小板膜糖蛋白介导，它们起着连接纤维蛋白原的作用，极大地促进血小板聚集和血栓的形成，因此，如果抑制血小板膜糖蛋白的表达，就可抑制血小板的激活，减弱凝血系统的活化对预防糖尿病心脑血管并发症的发生发展具有重要作用，其中最主要的血小板膜糖蛋白有CD62p、CD63和CD41/CD61(GPIIb/IIIa)等[5-6]。CD62p存在于静息血小板的α颗粒内，主要参与介导白细胞与内皮细胞的起始黏附、滚动、聚集及活化并释放炎症介质，参与了炎症过程，是目前所知最能反映血小板活化程度的特异指标之一。研究证实，在糖尿病状态下，CD62p表达的血小板显著增加，同时CD62p在糖尿病肾病和神经病变的发生与发展中也起重要作用[7-8]。CD63为血小板内溶酶体颗粒膜蛋白，在静息状态下血小板表面仅有极少量表达，血小板活化时可随脱颗粒反应而大量表达在血小板表面，并介导中性粒细胞对活化内皮的黏附，是检测血小板活化的理想指标，它不仅是活化血小板的特征性分子指标之一，而且在血栓形成中起重要作用，大量研究表明，2型糖尿病患者血小板因子CD63异常升高[9]。CD41/CD61是以活性状态存在于未被激活的血小板上，并不与黏附蛋白结合，但是当血管内皮受损后，血小板黏附在内皮细胞上，血栓素A 等诱导剂通过不同的细胞内信号改变CD41/CD61立体构型，使之激活，加速了血小板的黏附与聚集[7,10]。

大规模临床研究证明，他汀类药物不仅有调脂作用, 而且有重要的非调脂作用和对血管的直接效应，他汀类药物可影响凝血系统，对防治血栓形成并减少心血管事件发生有良好的作用，研究证实他汀类药物抑制血小板聚集的作用可能与下调血小板膜上的胆固醇水平，从而改变膜的流体性有关，但其抗血小板和血栓的作用很难用调脂解释[2,10]。本研究目的是了解他汀类药物辛伐他汀对糖尿病大鼠血脂水平和血小板膜糖蛋白水平的影响，结果证实辛伐他汀可以调节糖尿病大鼠的血脂水平，同时辛伐他汀可以抑制糖尿病大鼠血小板膜糖蛋白CD62p和CD63表达水平的升高，而CD41/CD61在对照组和糖尿病组之间没有差异，原因可能是血小板静息状态时已经表达大量的GPIIb-IIIa复合物，CD41/CD61是以活性状态存在于未被激活的血小板上，血小板激活活化后，不同的细胞内信号改变CD41/CD61立体构型，使之激活，其数量并没有发生改变，所以膜内外转位的糖蛋白对CD41/CD61影响不大，另外有研究显示2 型糖尿病伴血管病变组CD62p 显著高于无血管病变组及健康对照组，2型糖尿病伴血管病变、无血管病变和正常对照组之间的CD41/CD61差异无统计学意义[11]。辛伐他汀通过抑制CD62p和CD63的表达、减少炎症反应，阻止或延缓糖尿病心脑血管并发症的发生，其可能的原因为在高血糖诱导的炎症作用下，转录因子活化增强，大量从胞质转移到胞核，从而促进CD62p基因的表达，而他汀类药物通过激活二酰基甘油激酶(DGK)，从而抑制转录因子转位，导致下游CD62p基因的转录减少[12]。

综上所述，血小板膜糖蛋白的表达和糖尿病及其并发症有密切的联系，他汀类药物除了调脂的作用以外，还能通过减少CD62p和CD63的表达实现保护血管内皮功能、抑制血管平滑肌生长和抗凝血等作用，实现其非调脂作用的多效性，这从新的角度阐明他汀类药物对糖尿病心血管事件保护作用机制，为临床合理使用他汀类药物提供实验依据。

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