活体示踪干细胞治疗心肌梗死的分子影像技术进展

覃杰 单鸿

近年来使用干细胞移植治疗心肌梗死已取得可喜的成绩，但对干细胞移植治疗后干细胞的分布、归巢及分化等所知甚少[1-2]。若不能进一步了解移植后干细胞的分布、归巢及分化，将不能揭示干细胞治疗心肌梗死的机制，阻碍干细胞移植治疗在临床的应用。了解干细胞分布、归巢及分化的最好方法是通过分子影像技术活体示踪干细胞[2]。随着科学技术的不断发展，分子影像技术也得到了不断发展。活体示踪干细胞的分子影像技术已成为干细胞移植治疗的研究热点。本文将详细介绍示踪干细胞治疗心肌梗死的多种分子影像技术的最新进展，探讨其优缺点以及临床适用性。

一、示踪干细胞的分子影像技术

活体示踪移植干细胞分布及分化将有助于干细胞移植治疗心肌梗死的实验及临床研究的发展。示踪干细胞的分子影像技术有MRI、放射性核素成像、报告基因成像、光学成像以及高效有机整合几种成像技术为一体的多模态成像。

1.MRI

MRI是通过使用顺磁性对比剂来评价心脏结构和功能的最好技术[3]。MRI具有良好的空间 [10～100 μm(小动物磁共振)，500～1 500 μm(临床)]和时间分辨率，可示踪标记超顺磁和顺磁性对比剂的干细胞[3]。磁共振光谱成像(如19F MRI)亦可示踪移植心肌的干细胞[4]。

1.1超顺磁性氧化铁纳米颗粒

Arbab等[6]报道SPIO不影响细胞的活力、增殖、分化和迁移。然而,Schafer等[7]却发现SPIO会减少间充质干细胞移植和增殖能力以及干扰细胞功能等问题。SPIO可存在标记的干细胞内,亦可存在吞噬死亡干细胞的单核细胞内，因此无法根据MRI低信号来判断SPIO位于干细胞内还是单核细胞内[8]。此外,SPIO引起的低信号亦无法与含铁血黄素等血液衍生物引起的低信号相鉴别[9]。Winter等[10]报道MRI不能区别心肌内存活的干细胞及被巨噬细胞吞噬的死亡的干细胞。同样, Terrovitis等[11]认为MRI高估了SPIO标记的移植心脏的干细胞的存活情况。

1.2顺磁离子

钆(Gd)螯合物和锰(Mn)氯化合物等阳性对比剂标记的细胞在T1上表现为低信号。相对于SPIO，MRI对Gd标记的细胞的敏感度较低，因为Gd降低细胞内易与离子螯合的水浓度而降低弛豫效能[12]。此外,在溶酶体和内涵体内低pH的环境下，钆螯合物可能迅速去螯合而游离出可引起生物安全问题的Gd3+离子[12]。

氯化锰(MnCl2)和SPIO一样可标记和示踪干细胞，并有望提高MRI活体示踪干细胞的敏感性[13-14]。Yamada等[13]指出MRI可示踪亚毫摩尔浓度MnCl2标记的干细胞及活体评价MnCl2标记的干细胞活性。已有新型纳米对比剂如碳钆纳米管(Gadonanotubes)用于示踪干细胞,其降低T1弛豫效能好于目前已知的对比剂(为Gd对比剂40倍)[15]。若这些纳米对比剂被证实无毒，其定会在将来的分子影像中发挥重要作用。

1.319F MRI

虽然19F MRI尚未广泛应用于临床,但19F的一些特性可使19F MRI成为示踪干细胞治疗心肌梗死的较好方法之一；由于正常生物体内不含有19F，故19F MRI信号均来自外源对比剂,如全氟化碳粒子或氟化核苷；由于19F和1H旋比率仅差6%，故19F MRI可使用现有的1H MRI成像硬件[16]。

除了能像1H高选择性、高分辨率示踪移植干细胞外，19F还可定量检测细胞。Partlow等[17]已证实19F MRI能特异性识别、定位和定量干细胞。虽然19F示踪细胞已成为研究热点,但其仍处于发展的初期阶段，具有敏感度低、成像时间长的缺点。Srinivas等[16]试图通过完善成像硬件、成像序列及标记方法等来克服19F MRI的缺点，使其在示踪干细胞中发挥越来越重要的作用。

2.放射性核素成像

放射性核素成像包括正电子发射计算机断层显像(PET)及单光子发射计算机断层成像术(SPECT)。放射性核素成像具有灵敏度高(10-10～10-12mol/L vs 10-3～10-5mol/L MRI)及定量测量干细胞的优点，但也有一些缺点[18]：①空间分辨率(1～2 mm)低于MRI[18]。②仅适用于短期示踪干细胞，因为用于标记干细胞的放射性物质的半衰期较短[如：18F:110 min；111In(铟):2.8天；99 mTc(锝):6 h][19]。③核素的辐射会减弱细胞活力及增殖。如111In可发射引起生物副反应的Auger 电子。Brenner等[20]报道在移植干细胞术后48 h内尽管干细胞能进入梗死区域，但111In标记的干细胞的活性、增殖及分化明显受到抑制。Nowak等[21]报道小鼠造血祖细胞即使暴露于较低水平的放射性物质亦受到损害。

PET比SPECT具有更高的灵敏度(2到3个数量级)和更好的空间和时间分辨率。18F脱氧葡萄糖(18F-FDG)已用于标记细胞以及动物实验和临床研究的短期示踪干细胞。不管经过冠状动脉注射何种类型的干细胞及数量多少的干细胞，PET观察到的移植效果都不理想，在所有经过静脉注射干细胞的实验中，PET均没能在心肌内检测到标记的细胞[22-23]。

PET-CT具有更高的灵敏性,可非侵袭性显示冠状动脉解剖结构及示踪干细胞。这种多模态成像可解决18F短半衰期问题。Lang等[24]建议使用半衰期更长的同位素,如64Cu(12.7 h)。

3.报告基因成像

报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。报告基因成像将报告基因与探针(光学、核素、磁共振)结合在一起,通过探针显像报告基因产物的活性水平从而间接提供报告基因表达水平及驱动报告基因表达的内源性信号或转录因子水平的信息[25]。报告基因成像具有特异性识别存活细胞(包含基因产物)和中长期示踪干细胞(解决了探针随细胞增殖而被稀释的问题)的优点[25-26]。

报告基因成像已广泛应用于动物实验研究中。单纯疱疹病毒1型胸苷激酶 (HSV1-tk)及其突变体(HSV1-sr39tk)是目前使用最广泛的放射性核素成像示踪报告基因[25-26]。单纯疱疹病毒的tk与哺乳动物的不同,其通过高效磷酸化嘌呤及嘧啶核苷酸捕获配体。常用的HSV1-tk底物有：尿嘧啶核苷衍生物，如FIAU和FEAU；无环鸟苷类衍生物，如18F-羟甲基丁基鸟嘌呤(FHBG)和18F-羟丙基甲基鸟嘌呤(FHPG)。HSV1-sr39tk能更有效地利用无环鸟苷衍生物，标记探针的Vmax/Km值更高，成像效果更佳。因此，HSV1-sr39tk-18F-FHBG是目前最有效的PET报告基因。

Wu等[27]首先使用报告基因成像示踪移植心脏的干细胞。他们用18F-FHBG PET或生物发光成像(BLI)活体示踪治疗心肌梗死的干细胞(表达HSV1-sr39tk或荧光素酶)2周[27]。此外,Cao等[28]报道使用PET、BLI和荧光成像的三融合报告基因可观察小鼠胚胎干细胞(ESC)的生存和增殖。

虽然HSV-tk基因成像敏感性高，但由于免疫原性可能会限制其应用于人类。 Ponomarev等[29]提出使用人类线粒体胸苷激酶2型(hTK2)可克服免疫原性的问题。此外，人钠/碘同向转运体(hNIS)与124I 或99mTc合用可分别作为PET或SPECT报告基因[13,25]。 由于hNIS可在除心脏以外的器官(如甲状腺、胃、唾腺和脉络丛等)表达，因此hNIS无免疫原性，hNIS成像不需要合成复杂的探针[13,25]。

β-半乳糖苷酶、转铁蛋白受体、铁蛋白及高赖氨酸蛋白等均可作为MRI报告基因[30]。Naumova等[31]用MRI示踪表达铁蛋白的成肌细胞，但信号衰减高达25%，第3周后MRI已无法检测到信号。因此，目前活体MRI基因成像尚无法长期示踪干细胞。

报告基因成像示踪干细胞治疗心肌梗死尚存一些问题[32-33]。首先,报告基因表达的蛋白质可能会影响干细胞的一些细胞功能和治疗效果。其次,报告基因与宿主细胞染色质融合是否会导致基因突变而存在致瘤风险，仍存在争议。

4.光学成像

4.1BLI

BLI是荧光素酶基因标记的细胞或DNA在ATP及氧气存在的条件下表达荧光素酶, 荧光素酶氧化探针(D荧光素)发光,从而能够直接检测活体内的细胞活动和基因行为[27]。BLI已广泛应用于示踪干细胞移植治疗的动物实验研究[27-28]。BLI的优点是无创、灵敏度高、可定量分析、操作简单等，缺点是信号较弱、检测时间较长、实验设备成本高及细胞或基因需要转基因标记等[18,27]。

4.2荧光成像

荧光成像是通过激发光激发荧光报告基团(GFP、RFP, Cyt及dyes等)到达高能量状态后发光而成像[34]。近红外成像的出现促进了活体及离体监测干细胞的发展[27,34]。近红外成像通过减少光吸收和组织散射来增强信号穿透能力，因此其可断层成像。目前近红外成像限用于表浅器官成像及示踪干细胞的动物实验研究，将来其有可能应用于临床。Ly等[34]已成功在猪心肌梗死模型中示踪近红外染料IR-786标记的MSC，灵敏度可达10 000细胞。量子点是一种无机的荧光纳米粒子,已成功用于标记干细胞[35]。MSC的体外培养实验已证明量子点具有较低生物相容性，不影响细胞活性、增殖或分化[35-36]。量子点可标记干细胞分化过程中的多个转录因子，因此量子点有助于系统、深入地研究MSC的分化机制及调控干细胞的分化。Muller-Borer等[35]利用磁性/荧光量子点双功能纳米粒子成功标记大鼠干细胞,标记效率达90%以上。量子点对干细胞功能的长期影响尚不为人知,应关注其金属芯[铅、镉(Cd)和硒(Se)等]的暴露或溶解可能会导致的中毒[37]。

5.多模态成像

多模态成像是将敏感度高的光学成像和放射性核素成像以及解剖分辨率高的MRI等分子影像技术高效地整合成一体的成像技术。越来越多动物实验已应用多模态成像技术，并取得较好成绩。Qiao等[38]将已传染HSV1-sr39tk及标记SPIO的小鼠ESC注入健康或梗死心肌4周后，通过多模态成像可评估移植细胞的生存和增殖。Qiao等[38]发现ESC的存活及增殖在PET表现为18F-FHBG摄取增加，在MRI上由于SPIO被稀释表现为低信号区缩小，4周后多数SPIO存在于局部浸润的巨噬细胞内而非ESC内。动物实验显示ESC移植能略改善左心功能，但改善心功能的机制是旁分泌作用而非心肌细胞的增多,因为只有少于0.5%的ESC分化为心肌细胞[38-39]。Higuchi等[40]用已传染hNIS报告基因及标记SPIO的人脐带血内皮祖细胞移植治疗心肌梗死3天后，PET未能检测到124I，但MRI低信号可持续存在，说明移植细胞在短期内大量死亡，巨噬细胞吞噬死亡的SPIO标记的移植细胞。多模态成像的研究热点及重点是如何更有效地有机整合各种分子影像技术，使其在未来活体示踪干细胞的动物实验及临床研究中发挥重要的作用。

二、总 结

虽然已有不少较好的示踪干细胞的分子影像技术在动物实验中应用,但仍需不断完善才能应用于临床。除了具有争议的安全和伦理问题外,尚有以下悬而未决的关键问题：“最好的移植路径是什么?”“用何种细胞和用多少细胞移植?”及“何时移植?”。

显然,目前无单一的最佳分子影像技术示踪干细胞，因此最好能将具有灵敏度高(光学成像)、空间分辨率高(MRI)和功能成像(PET)的各种分子影像技术高效有机地整合为一体，构建多模态成像。未来分子影像技术应具有更高敏感度及特异度，更少免疫原性和致瘤性，以及更好药代动力学特性。

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