驱白艾力勒思亚散乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素生成的影响

窦 勤，闫 明，彭晓明，斯拉甫·艾白，李建梅*( 1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐 830049；2.新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830049)

白癜风是一种临床上常见的获得性的色素脱失性皮肤病，发病率约为4%，病因尚不清楚，虽然白癜风的治疗药物很多，但有效而不良反应少的药物仍然较少[1]。在维吾尔医治疗白癜风的诸多方剂中，本文遴选出具有代表性的复方制剂驱白艾力勒思亚散，通过酶学细胞实验筛选对小鼠B16细胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素生成的影响。酪氨酸酶活性是研究色素障碍性疾病的靶点[2-3]，维吾尔医对白癜风的治疗积累了不少成功经验，本实验采用小鼠B16黑素瘤细胞为模型，研究驱白艾力勒思亚散乙醇提取物对小鼠B16细胞的细胞增殖活性、酪氨酸酶活性以及黑素生成量的影响，探讨其治疗白癜风的作用机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 倒置显微镜(LaiKa公司)；自动酶标仪(MODEL550 BIO-RAD)。

1.2试药 胎牛血清和RPMI1640培养基，均由美国Gibco公司提供；二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、 L-多巴、四甲基偶氮唑蓝 (MTT)，购自美国Sigma公司；1640培养基(含2种抗生素：100 μg·mL-1链霉素、100 U·mL-1青霉素)。驱白艾力勒思亚散由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所自制；选择甲氧沙林(8-MOP)作为阳性对照药，该药由重庆华邦制药股份有限公司生产，实验时用二甲基亚砜溶解成低、中、高(10，50，100 μmol·L-1)3个浓度。

1.3细胞株 中国科学院上海细胞研究所提供(小鼠B16黑素瘤细胞株)。

2 方法

2.1乙醇提取物的制备 取适量驱白艾力勒思亚散在烘箱中适温焙干后，粉碎过筛，称取过筛后的粉末10 g，置于容器内，加入100 mL体积分数90%乙醇溶液，密封，均匀浸泡。2周后将滤液放入旋转蒸发仪浓缩成稠膏至干，称质量后用二甲基亚砜溶液溶解成10 mg·mL-1的溶液。1640培养基稀释后处理细胞，二甲基亚砜体积分数低于0.2%[3]。

2.2小鼠B16黑素瘤细胞培养 1640培养基(含体积分数10%小牛血清)在37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中常规培养，待细胞生长至融合状态时，用胰蛋白酶(体积分数0.25%)消化，每3天传代1次[4]，每瓶约105个细胞传代至25 cm2。

2.3细胞增殖活性测定(四甲基偶氮唑蓝法)

2.3.1细胞接种 取对数生长期细胞常规消化，取100 μL调整好的细胞液(5×104个·mL-1)，接种于96孔板，37 ℃、体积分数5%CO2培养24 h，每孔加100 μL稀释好的中药复方，使药物的质量浓度为低、中、高(2，10，20 μg·mL-1)3个质量浓度，每个质量浓度设立3个复孔。

2.3.2细胞增殖活性测定 设单纯培养基组、中药对照组(培养基+中药组)和空白对照组(培养基+细胞组) 为对照组，置于37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中作用72 h，每孔加5 mg·mL-1四甲基偶氮唑蓝溶液20 μL，在37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中作用4 h，弃上清，每孔加二甲基亚砜溶液100 μL，其吸光度值用酶标仪测定，用所测的吸光度值表示细胞增殖活性。

2.4黑素含量测定(氢氧化钠裂解法) 细胞接种方法与对照设置同上所述，药物作用72 h，弃上清液，用磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入氢氧化钠(100 μmol·L-1)，水浴1 h(37 ℃)，其吸光度值在酶标仪460 nm波长处测定，用所测的吸光度值表示黑素生成量。

2.5酪氨酸酶活性的测定 细胞接种方法与对照设置同上所述，药物作用72 h，弃上清液，用磷酸盐缓冲液冲洗2次，每孔加入100 μL体积分数1%聚乙二醇辛基苯基醚，震荡5 min，置于-20 ℃1 h，随室温融化，使细胞完全裂解，每孔加入100 μL用磷酸盐缓冲液配制的L-多巴液(体积分数0.1%)，37 ℃孵育2 h，其吸光度值在酶标仪460 nm波长处测定，用所测吸光度值表示酪氨酸酶的活性。

3 结果

3.1小鼠B16黑素瘤细胞增殖活性测定 细胞增殖活性=实验组的吸光度值-中药对照组的吸光度值，空白对照组细胞增殖活性=空白对照组的吸光度值-单纯培养基对照组的吸光度值[5-6]。

驱白艾力勒思亚散乙醇提取物在中质量浓度(10 μg·mL-1)有明显促进细胞增殖作用(P<0.05)，高质量浓度(20 μg·mL-1)有显著促进细胞增殖作用(P<0.01)，8-MOP在中、高2个浓度(50和100 μmol·L-1)下对B16细胞增殖有显著的促进作用(P<0.05)。结果见表1。

表1 复方乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖活性的影响

3.2黑素生成含量测定 黑素生成量=实验组的吸光度值-中药对照组的吸光度值，空白对照组黑素生成量=空白对照组的吸光度值-单纯培养基对照组的吸光度值[7]。

驱白艾力勒思亚散乙醇提取物在低、中质量浓度(5和10 μg·mL-1)有明显促进细胞黑素生成作用(P<0.05)， 高质量浓度(20 μg·mL-1)有显著促进细胞黑素生成作用(P<0.01)，8-MOP在低、中浓度(10和50 μmol·L-1)有明显促进细胞黑素生成作用(P<0.05)， 高质量浓度(100 μmol·L-1)有显著促进细胞黑素生成作用(P<0.01)。结果见表2。

表2 复方乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞黑素生成量的影响

3.3酪氨酸酶活性测定 酪氨酸酶活性=实验组的吸光度值-中药对照组的吸光度值，空白对照组酪氨酸酶活性=空白对照组的吸光度值-单纯培养基对照组的吸光度值[8]。

驱白艾力勒思亚散乙醇提取物在中质量浓度(10 μg·mL-1)有明显促进细胞黑素合成作用(P<0.05)，高质量浓度(20 μg·mL-1)有显著促进细胞黑素合成作用(P<0.01)，8-MOP在中、高浓度(50和100 μmol·L-1)有明显促进细胞黑素合成作用(P<0.05)。见表3。

表3 复方乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响

4 讨论

驱白艾力勒思亚散是由维药西青果、余甘子、诃子肉、黑种草子、巴旦仁组成的复方制剂，是维吾尔医治疗白癜风的经典剂型[9]。

本实验采用一般中药实验研究常用的醇提方法，研究驱白艾力勒思亚散对细胞的酪氨酸酶、小鼠B16黑素瘤细胞的增殖、黑素生成的影响，酪氨酸酶是黑素合成的关键限速酶[10-11]，以酪氨酸酶的活性为靶点是研究白癜风等色素障碍性疾病病因病理的关注点[12]。本实验结果显示，驱白艾力勒思亚散乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞的增殖有明显促进作用，对黑素合成有显著促进作用，对细胞的酪氨酸酶活性有显著的促进作用，其中高浓度作用明显，且各指标的一致性较好，通过本实验发现，8-MOP对B16有一定激活作用。维吾尔医治疗白癜风已积累了丰富的经验， 但其确切作用机制至今仍不清楚，本实验为治疗白癜风等色素障碍性疾病药物的细胞筛选奠定了实验基础。

参考文献：

[1] 秦万章.皮肤病研究[M].上海：上海科技出版社，1990: 525-538.

[2] Tobin D J，Wanson N N, Pittelkow MR, et al. Melanoeytes arei1 absellf in lesional skin of long duzationvitiligo[J]. J Pathol，2000，191(4): 407-416.

[3] 邓燕，杨柳.不同浓度的中药刺蒺藜对黑素细胞和酪氨酸酶的作用[J].第一军医大学学报，2002，22(11): 1017-1019.

[4] Simth B，Selby P，Southgate J，et al．Detection of melanoma cells in peripheral blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction[J]．Lancet，1991，338(87): 1227-1229.

[5] 任燕冬，宋宏杉，陈巧云，等.杏仁油对黑色素瘤细胞B16细胞增殖及黑素合成的影响[J].中国医药科学，2011，1(9): 15-16.

[6] 尚靖，敖秉臣，刘文丽，等.七种增白中药在体外对酪氨酸酶的影响[J].中国药学杂志，1995，30(11): 653-655.

[7] 刘之力，徐跃飞，涂彩霞，等.56味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性影响的研究[J].大连医科大学学报，2000，22(10): 6-10.

[8] 程东庆，王遂泉，尉晓冬，等. 复方中药对小鼠B16黑素瘤细胞株黑素合成和酪氨酸酶的激活作用[J].中华皮肤科杂志，2000，33(3): 173-174.

[9] 易沙克江·马合穆德.中国医学百科全书:维吾尔医学[M].上海: 上海科学技术出版社，2005:137.

[10]刘栋，朱文元，谭城.皮质类固醇对培养Cloudman S91黑素瘤细胞株黑素合成的影响[J].临床皮肤科杂志，2003，32(1): 3-6.

[11]杨建华，周言，胡君萍，等.维药没食子对酪氨酸酶抑制作用的研究[J].西北药学杂志，2014，29(1): 8-10.

[12]Matsuda H，Higashino M，Nakai Y，et al.Studies of cuticle drugs from natural sources. Inhibitory effects of arctostaphylos plants on melanin biosynthesis[J].Bio Pharm Bull，1996，19(1): 153-156.