蒙古山萝卜有效成分的分离、鉴定及含量测定

白音夫，周雪梅，周长凤，李德良，冯国庆，任小伟(.内蒙古自治区中蒙医研究所，呼和浩特 0000；.内蒙古自治区食品药品检验所，呼和浩特 00070)

蒙古山萝卜ScabiosacomosaFisch的花卉，为蒙医药治疗肝病的药材。蒙医认为，该药微甘、性凉，入肝、肺经，有清肝明目、祛火消积功效，用于肝热症、肝中毒、肝性消瘦、黄疸性肝炎，该药与其他药材配伍，可治疗多种肝脏疾病[1]。实验发现，该药可以提高小鼠血清溶菌酶、巨噬细胞溶菌酶、巨噬细胞酸性磷酸酶和巨噬细胞杀伤李斯特杆菌的活性；降低大肠杆菌内毒素的毒性；有解热、消炎作用；抗氧化、防治肝损伤与肝纤维化作用[2-5]。由于主要成分不明确，在蒙药药材标准中暂无测定方法[6]。本文对其主要成分分离、鉴定，在此基础上建立含量测定方法[7]。

1 仪器与试药

1.1仪器 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；TJ-912型色谱分析平台(太极计算机公司)；IN-180型柱温箱(上海英泰科技研究所)；SH6150D超声波清洗器(上海昆山仪器有限公司)；电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司)。

1.2试药 绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供；乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯。研究用蒙古山萝卜由呼和浩特市药材站提供；测定样品于2007年9月～2011年9月中旬采集于内蒙不同山区，采集的样品及时干燥，避光保存。

2 方法与结果

2.1结构分析

2.1.1提取 取蒙古山萝卜粉碎过60目筛，称取100 g，加800 mL石油醚(60～90 ℃沸程)回流提取1 h；药渣晾干，加水1 000 mL回流1 h，提取液趁热滤过，滤液放冷，加乙醇至体积分数为80%，搅拌，静置24 h;取上清液，滤过，减压回收乙醇并浓缩成清膏，低温干燥，粉碎成细粉；加200 mL乙酸乙酯超声处理，滤过，取滤液，蒸干，残渣加甲醇10 mL使其溶解，备用。

2.1.2薄层的制备与样品的分离 取硅胶G，加质量分数1%羧甲基纤维素钠，照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)制成(1.5 mm×200 mm×200 mm)的薄层板，备用。展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水(7∶2∶3)上层液。线性点样，展距140 mm，晾干，置于紫外灯(356 nm)下切割产生荧光区域的硅胶，用甲醇提取，过滤，蒸干甲醇，得白色结晶。

2.1.3鉴定 UVλmxaMeOHnm 330，244，220。IRvmaxKBrcm-13 400(-OH)，1 708(C=O)，1 660，1 640，1 620，985，835。MS：m/z354(M+)，180，163，130。HNMRδ6.25(1H，d，J=15.9 Hz，H-α)，6.82(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.97(1H，dd，J1=8.2 Hz，J2=2.1 Hz，H=67)，7.21(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，7.52(1H，d，J=15.9 Hz，H-β)。Rf、HPLC-tR值与绿原酸相同，UV、IRv图谱与绿原酸一致，确定结晶为绿原酸。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱Kromasil C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-3 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)；流速：1 mL·min-1；温度：30 ℃；检测波长328 nm；进样量10 μL，在此条件下待测组分可达到基线分离[1]。样品中绿原酸与其他组分有较好的分离，见图1。

2.2.2标准曲线制备 精密称取干燥至恒质量的绿原酸对照品适量，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mL含0.28 mg绿原酸溶液，作为对照品溶液。分别精密量取绿原酸对照品溶液0.25，0.5，1，2，3，4和5 mL，置于10 mL量瓶内，用甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件进行测定。结果，在质量浓度7～140 μg·mL-1范围内以峰面积(A)与对照品质量浓度(C)进行回归，其线性关系良好。回归方程：A=5 452.5+7 008.4C，r=0.999 0。

2.2.3供试品溶液制备 精密称取蒙古山萝卜药材0.2 g，置于50 mL具塞磨口瓶内，加甲醇10 mL，称质量，超声处理30 min，放冷，称质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液备用，即得。

图1 HPLC图

2.2.4精密度实验 精密抽取对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，连续进样6次，测得绿原酸峰面积的RSD为0.41%。

2.2.5稳定性实验 取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8和12 h进样，以绿原酸峰面积值计算RSD为0.71%。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.6重复性实验 精密称取样品6份，每份约0.2 g，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件进行分析，并计算含量，绿原酸含量的平均值(n=6)为3.20 mg·g-1，RSD为1.33%。

2.2.7回收率实验 取上述含量的同批样品6份，每份约0.12 g，置于50 mL量瓶中，依次分别加入0.1 mL(1 mL含绿原酸4.20 mg)对照品溶液，挥去溶剂，按供试品溶液的制备操作，测定含量，计算回收率。绿原酸平均回收率为101.2%，RSD为2.6%。

2.2.8样品测定 精密称蒙古山萝卜药材，按以上确定的方法制成供试品溶液，测定样品中的含量，不同产地样品中绿原酸含量分别为：呼和浩特蛮汉山0.242%，呼和浩特大青山0.278%，呼和浩特圣水梁0.360%，乌兰察布辉腾梁0.431%，呼伦贝尔红花尔基林场0.164%。

3 讨论

本文通过制备薄层分离蒙古山萝卜成分，经鉴定为绿原酸，在此基础上建立HPLC法测定药材中绿原酸含量的方法。对内蒙古不同产地的蒙古山萝卜中的绿原酸含量进行了分析，发现不同产地药材含量差别较大，可见气候条件对药材成分的影响。由于蒙古山萝卜是蒙医药治疗肝性疾病的特色药材，长期以来无含量测定方法，本实验研究为蒙古山萝卜建立含量测定标准，填补了空白，可为深入研究开发蒙古山萝卜提供参考数据。

蒙古山萝卜成分已有研究报道，但成分中未见绿原酸报道[8]。绿原酸具有多种活性，是药品、保健品原料。根据药材中绿原酸含量高低可基本确定药材品质和疗效。

用本法测定蒙古山萝卜中的绿原酸含量，其特点是样品预处理简单，回收率稳定，重复性好，可作为药材的质量评价方法。

参考文献：

[1] 内蒙古卫生局.内蒙古中草药[M].呼和浩特：内蒙古人民出版社，1972: 158-159.

[2] 田国才，刘朝，沈敬华，等. 蒙古山萝卜总黄酮激活小鼠腹腔巨噬细胞的动态研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1986，6(2): 107-111.

[3] 于洁，李希贤.蒙药兰盆花总黄酮对家兔外周血白细胞的影响[J].内蒙古药学，1986，4(1): 27-29.

[4] 白音夫，李锐峰，顾维章.蒙古山萝卜总黄酮解热、消炎、镇痛作用研究[J].内蒙古药学，1987，5(1): 43-45.

[5] 武桂枝，白音夫，常亮. 蒙古山萝卜酸对免疫性肝炎的保护及免疫调节[J].中国民族医药杂志，2007， 13(4): 55-56.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准:蒙药分册[S]. 1998: 52.

[7] 刘放，陈冰冰，吴小平.HPLC法测定菊花中绿原酸的含量[J].西北药学杂志，2010，25(5): 350-352.

[8] 王乃利，白玉霞，樊峥嵘，等.蒙古山萝卜活性成分的研究[J].中草药，1989，20(6): 7-9.