副溶血性弧菌实验室检测研究进展

张倩华 (广西那坡县疾病预防控制中心，广西 坡县 533900)

副溶血性弧菌是一种嗜盐性、引起人类肠胃炎的革兰阴性菌，通常栖息于温暖的海洋或河口环境中，与贝类有共生关系，带有毒力基因的菌株严重污染贝类［1］。近年来，由于贸易全球化，副溶血弧菌引起的食物中毒呈上升趋势［2］。因此，早期诊断、及时预防和治疗是控制该病的关键。副溶血性弧菌实验室诊断常用的方法有细菌培养、分离及生化和血清学鉴定，免疫学检测，聚合酶链反应(PCR)和环介导等温扩增技术等。本文将副溶血性弧菌检测技术进展综述如下。

1 细菌培养法

培养法是实验室检测副溶血性弧菌的传统方法。国标GB/T 4789.7-2008的检测步骤是样品经3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌后转种硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂或科玛嘉弧菌显色培养基，于37℃温箱培养18～24 h，观察菌落形态，挑选可疑菌落作生化试验或选用API20E生化鉴定试剂盒或VITEK进行鉴定［3］。凌秀梅等［4］按国标采用TCBS琼脂培养分离结合传统生化试验鉴定与科玛嘉弧菌显色培养基结合API20E生化鉴定作对比检测，两种方法检测结果一致，科玛嘉弧菌显色培养基结合API20E法在检测时间和操作步骤方面要优于前者。培养法不需要贵重设备，基层实验室都可以开展，但操作复杂、耗时4～7 d、特异性和敏感性不高。

2 免疫学检测

免疫学检测是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。血清学反应常用于副溶血性弧菌的血清学分型鉴定［5］，酶联免疫吸附试验 (ELISA)、免疫荧光技术［6］、免疫印迹［7］等也有学者应用于副溶血性弧菌的检测研究。

ELISA法具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，是免疫测定技术中应用最广的技术［8］，其基本原理是酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应，根据显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原。张蕾等［9］制备副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体并建立双抗夹心ELISA，对134株副溶血性弧菌和74株非副溶血性弧菌进行特异性实验，结果表明134株副溶血性弧菌呈阳性反应，74株非副溶血性弧菌呈阴性反应，该方法的检测灵敏度达到l×103CFU/ml菌液，与所测试的非副溶血性弧菌没有交叉反应。

3 基因扩增技术

基因扩增技术是分子生物学领域重要的研究手断，人们已建成了多种方法，其中PCR和环介导等温扩增技术是众多方法中较为常用于检测副溶血性弧菌的方法。研究表明，大多数副溶血性弧菌对人类不会致病，仅有少数携带耐热性溶血毒素(Thermostable direethemolysin，TDH)或TDH相关溶血毒素(TDH related hemolysin，TRH)或两者都有的副溶血性弧菌可以引起人类疾病［10］。最简单和最常用的诊断副溶血性弧菌是否具有致病性的指标是检测TDH和TRH基因［2］。此外，不耐热溶血素基因(tlh)、groEL和 toxR［11-13］基因普遍存在于临床和环境中的副溶血性弧菌中，许多研究将其作为检测副溶血性弧菌菌种特异性基因。

3.1 聚合酶链反应技术:聚合酶链反应(PCR)又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增技术。目前，临床上用副溶血性弧菌特异性高的毒力基因作为靶基因，常用的PCR有常规PCR、随机扩增多态性DNA-PCR(RAPD-PCR)、PCR-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)、多重PCR和实时荧光定量PCR等。

常规PCR检测副溶血性弧菌只需要设计一对相应的引物，扩增后用凝胶电泳鉴定［14］。RAPD-PCR的引物是随机合成或任意选定，长度一般为9～10个寡核苷酸［15］。PCRELISA是应用生物素标记引物，PCR扩增时，其产物结合到亲和素包被的塑料板上，再用地高辛标记的探针与PCR产物杂交，然后用抗地高辛的酶联反应检测。Kumar等［16］针对具有TRH的副溶血性弧菌纯化重组蛋白，制备单克隆抗体4B10，建立夹心PCR-ELISA法用于检测海产样品，结果灵敏度高且快速。多重PCR是在同一反应管中同时加上两对以上的特异性引物，进行PCR扩增，可对副溶血性弧菌基因进行分型。Hossain等［17］针对groEL、TDH和TRH基因设计引物，建立多重PCR检测海产样本中副溶血性弧菌，预期扩增产物分别为510 bp、382 bp和171 bp的DNA片段，该方法最低检出限为200个DNA/pg。上述常规PCR、RAPD-PCR、PCR-ELISA和多重PCR等均不能作定量分析，扩增后需用凝胶电泳鉴定，操作比较繁琐，同时扩增产物极易受到污染造成假阳性。实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用对荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。常用于检测副溶血性弧菌的荧光物质包括荧光探针和荧光染料。Tyagi等［18］采用荧光染料(SYBR Geenl)作荧光基团，以副溶血性弧菌TDH基因设计引物，建立实时荧光定量PCR，该方法的最低检出限量为每个副溶血性弧菌DNA 0.1 pg，R2值＞0.99，连续三天测试，其变异系数范围是1.2%～4.2%。龚璞等［19］用副溶血性弧菌TDH基因设计引物，建立Taq Man-MGB探针实时荧光PCR方法检测1株副溶血性弧菌标准株和44株副溶血性弧菌环境分离株的循环域值 (Ct值)均＜35，未增菌样品的最低检测下限为 25 cfu/ml，经6 h增菌后的下限菌量为2.5 cfu/ml;同时检测24株志贺菌、20株沙门菌、14株大肠杆菌、11株金黄色葡萄球菌，Ct值均＞35或无Ct值;经过3次重复试验，其Ct值的变异系数均＜5%。实时荧光PCR简化了传统PCR方法，实时检测采用完全闭管、荧光探针标记特定核酸的方法，避免了污染，并实现定量分析，准确性更高。

3.2 环介导等温扩增技术:环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是 Notomi等［20］针对副溶血性弧菌的TDH和TRH基因设计引物，开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，于2000年首次报道。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，该引物由内引物对(正向内引物)和向后内引物)和外引物对(向前外引物和向后外引物)组成。内引物包含识别和抗识别链的靶序列，而外引物仅含有抗识别链的靶序列。在LAMP第一步骤中，一条内引物启动链置换合成，通过外引物的退火将在同一靶链和后续合成的互补链产生的新产物链替换。以替换的产物链作为模板，通过第二内引物和外引物杂交形成的另一端靶DNA合成茎-环状的新链结构。第二轮LAMP反应以茎-环状新链作为模板开始链置合成，产生新的茎-环DNA结构，其中一个产物DNA长度增加两倍;反应继续，重复积累，产物DNA是扩增靶序列的交替反向重复序列，扩增的最后产物具有不同个数茎-环DNA结构。反应时间不到1 h，并产生109拷贝的靶DNA［21］。

目前临床上有许多学者进行LAMP技术应用于检测副溶血性弧菌研究。Yamazaki等［22］根据副溶血性弧菌TDH基因和TRH亚型基因(trh1、trh2)设计特异性引物，该方法将tdh、trh1、trh2基因设计成联合和单个检测，并对反应条件进行优化。他们建立的LAMP体系具有高度特异性，对125株副溶血性弧菌、3株霍利斯格里蒙菌及2株携带tdh、trh1、trh2基因的拟态弧菌进行检测，与用DNA探针和常规PCR检测的结果一致，对20株缺乏TDH、trh1和trh2基因的任何一株细菌进行扩增时均为阴性，该方法仅需要27～60 min，简单快速。吴家林等［23］针对副溶血性弧菌不耐热溶血素(tlh)基因和tdh设计两套引物，建立环介导等温扩增技术检测方法，用PCR法作比较，并进行了虾肉模拟样品和实际样品检测。结果环介导等温扩增技术特异性和灵敏度高于PCR法，对细菌纯培养物的检测灵敏度为101cfu/ml，对虾肉模拟样品检测灵敏度103cfu/g。而PCR法的灵敏度分别为102cfu/ml和105cfu/g。采用环介导等温扩增技术在69份实际样品中检测出11份tlh基因阳性，其中2份tdh毒力基因阳性。由于副溶血性弧菌的toxR基因编码序列的内膜“系链”区域具有高度特异性，可用于区分不同的弧菌，Chen S等［24］针对副溶血性弧菌toxR基因，设计了5种引物，建立LAMP核酸扩增基因技术，对36株副溶血性弧菌和39株其他细菌进行特异性检测，并用牡蛎作加标试验，同时用toxR-PCR法作对比检测，结果toxRLAMP法在每个纯培养反应的最低检出限为47～470个细胞，加标试验，能够检测出每克牡蛎含1.1×105个副溶血性弧菌细胞，敏感性均比toxR-PCR法高100倍，在这两种纯培养和加标牡蛎样品检测副溶血性弧菌产生的标准曲线显示细胞数和荧光或浊度信号之间呈良好的线性关系。

LAMP具有操作简单、快速、特异性强等特点，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于实时荧光定量PCR，也不需要昴贵的仪器设备即可开展，目前已应用于病毒、细菌、寄生虫和食品安全的检测［25］。

目前，临床上检测副溶血性弧菌的常用方法仍为细菌培养法，因其所需设备要求不高，已在基层实验室广泛应用，但操作复杂、费时，不能做到早期诊断。免疫学方法因其灵敏性和特异性尚不理想，而且试盒成本高，目前还不为临床广泛接受。DNA探针法费时且操作繁杂。常规PCR分析虽然提供了快速检测，但需琼脂糖凝胶电泳，也耗时、繁琐。近年来兴起的实时PCR检测比常规PCR检测更快速，但需要昂贵的设备，检测费用高，限制其在基层实验室广泛使用。最近发展起来的环介导等温扩增技术可作一步法基因扩增进行简单的浊度分析，不需要高度精确和昂贵的设备，只需要一个简单的恒温水浴箱即可开展工作，比PCR法检测更快，更容易执行。随着LAMP技术的不断完善，在副溶血性弧菌诊断上将具有良好的应用前景。

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