沙门氏菌检测方法的研究进展

2014-08-15郭立明张雪厉华明

生物技术世界 2014年9期

郭立明张雪厉华明

(1.日照市疾控中心山东日照 276826;2.日照市第三中学山东日照 276812;3.日照市卫生学校山东日照 276826)

沙门氏菌是一种常见的人兽共患病原菌,不仅会引起各种动物疾病,而且与人类多种疾病有关,其中由沙门氏菌引起的食物中毒显得尤为突出。根据世界卫生组织报告, 1985年以来,在世界范围内,由沙门氏菌引起的已确诊的患病人数不断增加,在一些欧洲国家已增加五倍以上。而在我国,由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计,在我国细菌性食物中毒中,70%～80%是由沙门氏菌引起,而在引起沙门氏菌中毒的食品中,90%以上是肉类等动物性产品。这不仅造成了巨大经济损失,而且严重威胁着人们的身体健康和生命安全,这使得沙门沙门氏菌的研究和预防显得极为重要,而沙门氏菌的检测方法正式这项工作开展的重点。笔者参考了国内外文献,认为沙门氏菌研究方法主要包括三个方面:传统标准检测法、免疫学法和分子生物学法。传统方法是一种国标货国际检测的基本方法,但是它鉴定过程复杂,且耗时较长;免疫法是基于抗体的检测方法,主要包括酶联免疫吸附、斑点酶联免疫吸附、免疫荧光标记等,它不仅将检测时间缩短了一半,且灵敏性高和特异性强;分子生物学法主要是以核酸为基础的PCR技术,由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于沙门氏菌检测。

1 传统标准检测方法

传统方法是国标法或国际法的一种基本方法,它方法简单、准确、可重复性强、有一定的灵敏性,最终能够分离到细菌纯培养物,因而也常常作为其他检验方法的准确性、敏感性的参照。传统方法检测主要包括五个步骤:前增菌和增菌;分离纯培养物;属和种的鉴定;血清学分型;菌型的判定和结果报告。虽然方法简单,但是过程复杂,且耗时长,全过程需要5个小时左右才能得出明确的诊断结果。

2 免疫学方法

免疫学方法基本原理是抗原和抗体的特异性结合。首先用分子标记已知的抗体或抗原,其次使得标记抗原或抗体与检测物反应,通过标记物来观察是否存在抗原抗体特异性免疫反应,从而判断出微量沙门氏菌的存在与否。该法不仅将检测时间缩短了一半,而且具有很高的灵敏性和特异性,主要包括酶联免疫吸附、斑点酶联免疫吸附、免疫荧光标记。

2.1 酶联免疫吸附

酶联免疫吸附基本原理是将抗原或抗体预先结合在某种固相载体表面,然后加入受检样品和酶标抗原或抗体,使其与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原抗体复合物,经洗涤去除反应液中其他物质,加入酶反应底物后,底物被固相载体上的酶催化变为有色产物,最后通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质含量。

2.2 斑点酶联免疫吸附

Dot-ELISA是以纤维素膜作为固相载体的一种新型免疫检测技术,其原理与常规ELISA法相同,可用于抗原或抗体的定性或定量检测。其与ELISA的不同之处在于:一是将固相载体以硝酸纤维素滤膜、确酸醋酸混合纤维素滤膜、重氮节氧甲基化纸等固相化基质膜代替,用以吸附抗原或抗体;二是显色底物的供氢体为不溶性,结果在基质膜上出现有色斑点进行判定。该方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。

2.3 免疫荧光标记

免疫荧光抗体技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗体,再用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色),可以看见荧光所在的组织细胞,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。

3 分子生物学方法

分子生物学方法发展迅猛,在沙门氏菌探测中也发挥着重要作用,主要包括:聚合酶链反应(PCR)技术、基因芯片技术、荧光定量PCR。

3.1 聚合酶链反应(PCR)技术

PCR技术是一项体外酶促扩增DNA技术,具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。目前,PCR技术是一种快速、简便、特异、灵敏检测沙门氏菌的方法。2005年,汪琦等以全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉为试验对象,人为添加沙门氏菌,利用PCR方法快速检测食品中的沙门氏菌,检测结果与传统培养方法系统检测结果一致,检出限为100CFU/25g,准确性达100%。

3.2 基因芯片技术

基因芯片是固定有很多已知序列DNA探针的硅片或玻片。将经过荧光标记的样品分子与基因芯片上的DNA探针进行杂交,通过检测每个探针分子的荧光信号强度以得到样品分子的数量和序列信息,从而检测沙门氏菌是否存在。鉴于基因芯片表面的DNA探针从几十到几百万个不等,因而可以一次性检测多种沙门氏菌,并同时得到病原菌的耐药性等情况。