外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中高效表达的策略

邓辉

(武汉生物工程学院生命科学与技术学院 湖北武汉 430415)

巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,其表达系统是近些年发展起来的一种真核表达系统,它与酿酒酵母有着很多相同的遗传学和生物学特性。优点概括为三点:高稳定、高表达、高分泌。相对其它酵母来说更加易于操作。毕赤酵母相对其它酵母更易于分泌外源蛋白,而且外源基因整合非常稳定,发酵工艺相对成熟,宿主细胞生长迅速。毕赤酵母能够进行高密度的发酵,有着很强的诱导启动子。不仅如此,毕赤酵母重组产物的生物活性比较高,其表达水平是其它酵母的10～100倍。表达可以到达75%。正是由于表达水平高,所以作为外源蛋白表达系统的毕赤酵母才会被广泛运用于商业化生产外源蛋白。其中25%的影响主要分为以下七点:(1)启动子的影响。(2)外源基因的自身影响。(3)外源基因拷贝数的影响。(4)遗传背景的影响。(5)蛋白质分泌的影响。(6)发酵条件的细微影响。(7)外源蛋白的加工修饰。

1 外源基因的选择

外源基因自身的特性主要包括三个方面:(1)mRNA5’端非翻译区(5’-2UTR)。(2)基因的A+T组成。(3)密码子使用频率。由于乙醇氧化酶在毕赤酵母(P.pastoris)中的表达程度极高(约占胞内可溶性蛋白的30%)所以外源基因mRNA5’－UTR只有尽可能和AOXl mRNA5’－UTR保持一致,这样才会有相对较高的蛋白表达率。由于终止密码子的A+T含量丰富,所以在A+T丰富区可能会存在转录提前终止的密码子,基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录活动提前终止的主要原因正是因为基因中A+T含量相对较高。因此改变这一现象的方法就是对A+T含量丰富的基因重新进行序列设计,使其A+T含量尽可能保持在30%～55%范围之内,尽可能避开终止密码子。

2 表达载体的优化

(1)强启动子的选择;启动子在转录时为了表达调控基因,一般会选择Aoxl启动子。因为甲醇诱导性很强,外源基因可以在其中得到更高程度的表达。使用其它启动子所到达的表达效率则大大低于Aoxl启动子。PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在(P.pastoris)毕赤酵母中复制出来的一个组成型启动子,该组成型启动子不需要甲醇进行诱导,所以其发酵工艺相对更加简单。所以在不久的将来,它是否会成为了代替PAOX1最强的启动子,人类对此还有待研究。(2)信号肽的选择;分泌表达不仅可以减轻宿主细胞代谢负荷,还可以减少宿主细胞内部的蛋白酶对外源蛋白的降解.分泌表达是如今最理想的蛋白质表达方式。迄今为止,人类的血清蛋白和牛凝血酶均是利用外源蛋白自身产生的信号肽与酵母信号肽表达外源蛋白的成功典例。如果外源蛋白自身产生的信号肽的序列表达效果不佳,可以尝试甲醇酵母的信号肽。

3 外源基因的整合拷贝数增加

为了可以有效地获得高产量,巴氏毕赤酵母载体在宿主染色体上大多数为单拷贝整合。由于PAoxl在甲醇诱导下整合后稳定,所以即使单拷贝体也可以获得高产量。目前有效提高外源基因整合拷贝数的方法主要有以下三种:(1)巴氏毕赤酵母的转换方法主要是原生质体法、电击法、氯化锂法等。最近在质粒pPIC9K上发现带有G418的抗性基因,这种抗性基因可以利用转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子。(配合电击法效果最佳)(2)在体外载体上多次插入目的基因的片段。但是这种方法拷贝整合不稳定,而且数量有限,所以并不常用。(3)将来自宿主或其它非必需高重复的基因片段与载体中目的基因的两端连接,通过同源重组的方式从而达到高拷贝整合的目的。

4 发酵条件的优化

4.1 影响表达最为重要的因素就是通气量

之前大多数会采用普通摇瓶进行发酵,由于普通摇瓶发酵的通气效果不理想,会影响到菌体的高密度生长及表达。所以现在一般情况下会用发酵罐进行培养,外源蛋白在发酵罐中的表达水平会比在普通摇瓶中发酵量高出10～100倍.从前大部分报道的结果都是在摇瓶发酵条件下产生的。所以推测,如果采用发酵罐进行发酵,其表达水平还将会有很大的提升空间。

4.2 影响高水平表达的重要因素之二——碳源

毕赤酵母表达培养基常用的碳源是甘油,但有些情况会用山梨糖醇代替甘油来作为碳源。虽然使用山梨糖醇得到的生物质量下降,但外源蛋白的表达程度却得到了大大的提高。相对甘油对AOX启动子具有抑制作用的影响,结果上来看,使用山梨糖醇作为碳源表达程度上相比甘油大得多。

4.3 培养基组成

可用于培养P.Pastoris的培养基迄今为止主要有BMGY和FBS两种。但因为BMGY含有磷酸缓冲液还有蛋白胨和酵母提取物,这几种物质可以使菌株生长更好,从而大大增加了生物量,产量也得到了很大程度的提高。

4.4 使用甲醇进行诱导的时间、用量、诱导方式

诱导的方式:(1)两步法,首先用甘油培养细胞使其达到一定的浓度,再加入一定量的甲醇进行诱导。(2)联合生长培养的方法,在早期加入甲醇诱导来诱导外源蛋白的表达。如果使用两步法来诱导外源蛋白的表达,为了使得毕赤酵母能够高效表达重组蛋白,关键要素就是诱导时的起始pH值。如果改变诱导时的pH值,外源蛋白表达量可以提高至少50%。使用growth-associated诱导甲醇酵母高水平表达外源基因,会比一般方法产生的结果高出近10倍。

5 结语

综上所述,尽管毕赤酵母自身还存在许多缺点和不足,如在某些情况下会出现表达量低和无效分泌等。但不可否认毕赤酵母表达系统是外源蛋白高效表达的最佳载体,正因为如此,还有很多内容值得我们去研究和探索,相信随着进一步的深入研究探索,不断地积累经验和改良表达系统,会有越来越多的外源基因在毕赤酵母系统中成功高效表达。毕赤酵母在生物制药领域将发挥越来越重要的作用。