多重耐药鲍曼不动杆菌的临床分布及其外排泵基因型分析

孙静娜，刘泽世，王国欣，刘青松，张 征

(1河北医科大学第一医院，石家庄050031;2容城县人民医院)

鲍曼不动杆菌可以在住院患者中发生定植，很容易通过交叉感染在医院内流行，而且多重耐药鲍曼不动杆菌日趋增多，尤其在ICU、严重烧伤病房的耐药菌株的出现，给临床抗感染治疗带来很大困难。主动外排泵系统是多重耐药鲍曼不动杆菌临床分离菌株产生多药耐药性的主要机制之一［1］，参与了鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物、β-内酰胺类药物、氯霉素、红霉素和四环素的耐药。本研究对多重耐药鲍曼不动杆菌在不同临床科室的分布情况及其外排泵基因型进行了分析。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2012～2013年河北医科大学第一医院不同科室送检的标本(包括痰液、尿液及血液等)中分离出的多重耐药鲍曼不动杆菌共96株(同一患者多次分离到的同一菌株不重复计数)。取纯培养细菌增菌液1 mL与0.5 mL的50%甘油肉汤混匀，-70℃冰箱保存并备用。标准菌株鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器及设备 Maxwell16核酸提取仪为美国Promega公司产品;Mini-4K/6K微型离心机为珠海黑马医学仪器有限公司产品;AB 9700PCR扩增仪为美国AB公司产品;DYY-12电泳仪为北京六一仪器厂产品;VilBer LouRMAT凝胶成像系统为法国VILBER LOURMAT公司产品;SIGMA 3-18K台式冷冻离心机为德国Sigma公司产品。

1.3 试剂 外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM及16SRNA的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。DNA提取试剂盒Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit和 PCR扩增 GoTaq® Green Master Mix、GoTaq® Colorless Master Mix购自美国Promega公司。DNA染色剂Goldview、DNA Ladder Marker购自北京赛百盛公司。琼脂糖X-gal购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.4 多重耐药鲍曼不动杆菌在不同临床科室的分布情况统计 按临床科室统计96株多重耐药鲍曼不动杆菌的分布情况。

1.5 多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 的检测 用 PCR 技术检测。①DNA提取:使用Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit试剂盒，操作见说明书。②adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因 PCR 引物设计:根据GenBank中的各型基因序列并参考文献［2］自行设计基因引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。adeB:扩增产物长度约541 bp，引物A为5'-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3'(AF370885)，引物B为5'-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3'AF370 885);adeR:扩增产物长度约447 bp，引物A为5'-ACTACGATATTGGCGACATT-3'(AY426969)，引物B为5'-GCGTCAGATTAAGCAAGATT-3'(AY426969);adeS:扩增产物长度约544 bp，引物A为5'-TTGGTTAGCCACTGTTATCT-3'(AY426969)，引物 B为5'-AGTGGACGTTAGGTCAAGTT-3'(AY426969);adeJ:扩增产物长度约453 bp，引物 A为5'-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3'(AY769962)，引物 B为 5'-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3'(AY769962);adeE:扩增产物长度约504 bp，引物A为5'-GAGCTGAGGATTCTCTATGT-3'(DQ223769)，引物B为 5'-AGTGTGCTCACCATATAGTC-3'(DQ223769);adeM:扩增产物长度约303 bp，引物 A为5'-GTAGGTGTAGGCTTATGGA-3'(AY147867);引物 B为5'-GTACCGAAGTGACTGAAAT-3'(AY147867)。③PCR反应体系及条件:PCR反应体系(25 μL)配置:DNA模板4 μL，引物 A 和引物 B 各 1 μL，2 × GoTaq® Green Master Mix 12.5 μL，RNase-free 水 6.5 μL。PCR 反应条件:94℃预变性5 min，然后进入循环;94℃变性1 min，55 ℃退火 50 s，72 ℃ 延伸 1 min，共进行30个循环;最后72℃延伸5 min。④PCR反应产物电泳、判定:缓冲液0.5×TBE，电压100 V，上样标本量 8 μL，DNA 分子量 Maker(100 bp)8 μL，电泳50 min，置于全自动凝胶图像成像仪上观察结果并照相，出现与目的基因片段分子相当的条带判为阳性。

2 结果

2.1 多重耐药鲍曼不动杆菌在不同临床科室的分布 96株多重耐药鲍曼不动杆菌分布在ICU 52株(54.2%)、呼吸内科 18 株(18.8%)、烧伤科 9 株(9.4%)、肿瘤科6 株(6.2%)、普外科4 株(4.2%)、肾内科 2 株(2.1%)、心内科 2 株(2.1%)、儿科 2 株(2.1%)、精神科1 株(1.0%)，主要分布在 ICU 和呼吸内科。

2.2 多重耐药鲍曼不动杆菌的外排泵基因型 96株多重耐药鲍曼不动杆菌检测到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因者分别有 33、32、33、33、0、33株，阳性检出率分别为 34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。分布在 ICU 的52株多重耐药鲍曼不动杆菌检测到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因者分别有 18、16、18、18、0、18 株，阳性检出率分别为 34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%;分布在呼吸内科的18株多重耐药鲍曼不动杆菌检测到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因者分别有 9、8、8、8、0、8 株，阳性检出率分别为50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%。

3 讨论

由于鲍曼不动杆菌在自然环境和医院环境中普遍存在，而且具有极强的环境适应能力和快速获得耐药性的能力，因而鲍曼不动杆菌是引起院内感染的最为重要的机会致病菌之一［3］。鲍曼不动杆菌通过其酶机制、外排泵等极容易形成耐药菌株［4］。主动外排泵是由菌体细胞膜表面蛋白组成的，可以将进入细菌体内的抗菌药物经外排泵排出到细胞外，而外排泵的过度表达引起喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类抗菌药物及氯霉素的敏感性降低［5，6］。台湾学者 Sun 等［7］研究发现 adeB 的高表达与鲍曼不动杆菌临床株对替加环素的耐药性有关。联合用药成为治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的新选择，并防止耐药菌株的产生和医院内感染的扩散［8～10］。

本研究结果显示，96株多重耐药鲍曼不动杆菌中，分布于 ICU的占54.2%，与李娟等［11］报道来自ICU的鲍曼不动杆菌占66.9%基本一致，表明ICU是多重耐药鲍曼不动杆菌感染的高发病区，可能是与ICU患者自身基础性疾病较重、免疫力低下、大量使用抗菌药物、大多数患者有机械通气及介入治疗的医疗行为给该菌的感染提供了有利环境及途径有关［12］。分布于呼吸内科的多重耐药鲍曼不动杆菌占18.8%，其他的分布在烧伤科、肿瘤科、普外科、儿科、心内科、精神科等多个科室。上述结果表明，在不同的环境中，鲍曼不动杆菌的分布不同，在患者病情严重、住院时间长、机体免疫力下降，尤其是长时间机械通气时，多重耐药鲍曼不动杆菌的感染逐渐增多。

在本研究中，96株多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 检出阳性率分别为34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。Marchand等［13］提出，adeR和adeS的出现可能与adeABC的过表达相关，增加了耐药的概率。Yoon等［14］认为，AdeR是一个典型的调节转录因子，AdeS激活细菌组氨酸激酶，二者一起针对外界刺激调节目的基因表达。上述结果表明，外排泵基因的存在是鲍曼不动杆菌出现多重耐药的重要机制。

分布在ICU的52株多重耐药鲍曼不动杆菌中adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因检出阳性率分别为34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%，与总的检出阳性率基本一致;分布在呼吸内科的18株多重耐药鲍曼不动杆菌中 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因检出阳性率分别为50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%，与总的检出阳性率相比高出11.11%～16.67%。这可能与ICU中的医护人员对多重耐药菌感染防治意识较强、工作更加规范有关。

总之，本研究结果表明多重耐药鲍曼不动杆菌主要分布在 ICU(54.2%)和呼吸内科(18.8%)，其外排泵基因型主要为 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeM，这是鲍曼不动杆菌发生多重耐药的重要因素。

［1］任常洁，曲彦，关纯，等.多药耐药鲍氏不动杆菌外排泵adeA基因的检测及分析［J］.中华医院感染学杂志，2013，23(7):1484-1486.

［2］Hou PF，Chen XY，Yan GF，et al.Study of the correlation of imipenem resistance with effluxpumps AdeABC，AdeIJK，AdeDE and AbeM in clinical isolates of Acinetobacter baumannii［J］.Chemother，2012，58(2):152-158.

［3］Moultrie D，Hawker J，Cole S.Factors associated with multidrugresistant Acinetobacter transmission:an integrative review of theliterature［J］.AORN J，2011，94(1):27-36.

［4］宋彩虹，陆水英，张秀瑜，等.鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性及同源性分析［J］.中国微生态学杂志，2013，25(2):161-164.

［5］佘婷婷，沈继录，徐元宏，等.泛耐药鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素机制研究［J］.安徽医科大学学报，2012，47(3):274-278.

［6］Rajamohan G，Srinivasan VB，Gebreyes WA.Molecular and functional characterization of a novel efflux pump，AmvA，mediating antimicrobial and disinfectant resistance in Acinetobacter baumannii［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65(9):1919-1925.

［7］Sun JR，Chan MC，Chang TY，et al.Overexpression of the adeB gene in clinical isolates of tigecycline-nonsusceptible Acinetobacter baumannii without insertion mutations in adeRS［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(11):4934-4938.

［8］乔淑新，于云翔.呼吸内科病房泛耐药鲍曼不动杆菌的耐药性及临床用药分析［J］.天津医药，2013，4(11):1126-1127.

［9］田雪，修清玉.泛耐药鲍曼不动杆菌感染的联合治疗［J］.山东医药，52(15):83-85.

［10］王悦，宋诗铎，何屏，等.鲍曼不动杆菌多重耐药及其播散机制的研究进展［J］.山东医药，2013，53(35):92-95.

［11］李娟，郝邯生，王悦，等.医院内鲍曼不动杆菌感染分布特征及其耐药机制［J］.山东医药，2013，53(5):18-21.

［12］杜红丽，甄萍，姚新洁，等.2005～2011年鲍曼不动杆菌的临床分布与耐药性变迁［J］.现代预防医学，2013，40(20):3848-3850.

［13］ Marchand I，Damier-Piolle L，Courvalin P，et al.Expression of the RND-type efflux pump AdeABC in Acinetobacter baumannii is regulated by the AdeRS two-component system［J］.Antimicrob A-gents Chemother，2004，48(9):3298-3304.

［14］Yoon EJ，Courvalin P，Grillot-Courvalin C.RND-type efflux pumps in multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii:major role for AdeABC overexpression and AdeRS mutations［J］.Antimicrob Agents Chemother，2013，57(7):2989-2995.