HBV相关肝细胞癌组织中CDC37基因启动子微卫星多态性及其与基因表达的关系

陈朝武，刘 宇，徐 莹，杨贵奉，王战会，姜荣龙

(南方医科大学南方医院，广州510515)

微卫星是一种广泛存在于生物基因组中的由1～6个核苷酸组成的简单串联重复序列，又称为短串联重复序列或简单重复序列。人类基因组中二核苷酸重复序列(CA/GT)n是最为常见的微卫星形式之一，n为重复次数，通常为15～60次。微卫星具有高度的多态性和个体特异性，并且可以稳定遗传。CDC37蛋白是一种与细胞分裂周期有关的蛋白，能特异性地与未成熟的蛋白激酶结合并进而与热休克蛋白90结合，使蛋白激酶正确折叠和成熟。CDC37蛋白作为一种重要的蛋白激酶特异性辅助分子伴侣，与肿瘤发生过程中多条信号通路的活化密切相关［1，2］。我们的研究发现，CDC37在肝细胞癌(HCC)组织中的表达明显高于癌旁组织和正常肝组织，那么CDC37基因启动子区是否存在微卫星多态性，微卫星多态性是否会影响CDC37的表达，从而影响HCC的发生和发展，目前还未见相关报道。为此，我们对乙型肝炎病毒(HBV)相关HCC患者的癌组织和癌旁组织中CDC37基因启动子序列进行了观察，并对癌组织和癌旁组织中CDC37启动子微卫星多态性的组成形式进行了分析。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012～2013年在南方医科大学南方医院接受手术治疗的HBV相关HCC患者22例，男18例，女4例;年龄28～71岁。术中分别留取其肿瘤组织(HCC组织)及癌旁正常肝组织(癌旁组织)。有13例患者的HCC组织中CDC37表达水平高于相应癌旁组织(CDC37过表达)，9例患者的HCC组织中CDC37表达水平不高于相应癌旁组织(CDC37无过表达)。

1.2 HCC组织及癌旁组织DNA的提取 每例份组织标本称取30 mg，采用组织基因组DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN公司)提取基因组DNA，最后用NANO DROP2000检测所提DNA的纯度及浓度。

1.3 CDC37启动子序列的扩增、克隆、测定及比对以提取的DNA为模板对CDC37启动子含微卫星区段序列进行PCR扩增。引物序列由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，上游引物序列:5'-ATTATCCTGGT-ATCAAAGCGTG-3'，下游引物序列:5'-GACCTAAGCCTGCGCTGGA-3'。PCR反应体系共30 μL:基因组 DNA 3 μL，10 × Buffer 3 μL，上下游引物各 0.3 μL，dNTP 2.4 μL，Taq 酶 0.3 μL，去离子水20.7 μL。PCR循环参数为94℃预变性5 min后，进行 35 个循环:94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、40 s，最后72℃延伸5 min。

采用PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN公司)回收、纯化PCR产物。将纯化后产物与PMD-18T Vector(TaKaRa公司)进行TA克隆连接反应，反应体系共 10 μL(灭菌蒸馏水 1 μL，SolutionⅠ连接缓冲液5 μL，PMD-18T Vector 1 μL，纯化 DNA 3 μL)，4 ℃条件下连接12～18 h。将上述连接产物转化感受态细菌JM109，取适量菌液均匀涂抹于氨苄抗性LB平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆培养后PCR鉴定阳性克隆，最后每例组织标本至少送3个克隆进行测序。采用Mega5.05软件对测序结果进行排列，并与CDC37启动子参照序列进行比对，对不同组织标本中CDC37启动子微卫星多态性进行分析。1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。组间微卫星模式分布比较用Fisher确切概率法，两个率的比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织及癌旁组织中CDC37基因启动子区微卫星形式 22例患者的癌组织共有93个克隆进行了序列分析，癌旁组织共有101个克隆进行了序列分析。测序结果表明CDC37基因的启动子区存在(GT)n1-GC-(GT)n2微卫星形式，位于CDC37启动子区的1 368～1 415位;主要的组成形式中n1有8、9、10共3种重复形式，n2有8～13共6种重复形式;(GT)n1和(GT)n2以多种不同的组合方式存在，其中n1为10的组合方式最为多样，(GT)10-GC-(GT)9最为常见，其次为(GT)10-GC-(GT)12和(GT)10-GC-(GT)13两种形式;其中(GT)8-GC-(GT)13、(GT)9-GC-(GT)9、(GT)9-GC-(GT)10、(GT)9-GC-(GT)12、(GT)9-GC-(GT)13、(GT)10-GC-(GT)8、(GT)10-GC-(GT)9、(GT)10-GC-(GT)10、(GT)10-GC-(GT)11、(GT)10-GC-(GT)12、(GT)10-GC-(GT)13、其他形式在HCC组织(共93个克隆)中分别为 0、7、1、4、3、3、31、2、2、17、13、10 个克隆，在癌旁组织(共101 个克隆)中分别为 2、9、1、0、4、4、40、0、0、17、19、5 个克隆。HCC 组织主要有 10 种微卫星组成形式，癌旁组织主要有8种，但两组之间不同组合形式的微卫星分布相比，P＞0.05。

2.2 CDC37基因启动子区微卫星形式与CDC37表达的关系 13例份HCC组织中CDC37过表达者，其HCC组织克隆数为66个、癌旁组织克隆数为67个;9例份HCC组织中CDC37无过表达者的HCC组织克隆数为27个。微卫星(GT)9-GC-(GT)9、(GT)9-GC-(GT)10、(GT)9-GC-(GT)12、(GT)9-GC-(GT)13、GT)10-GC-(GT)8、(GT)10-GC-(GT)9、(GT)10-GC-(GT)10、(GT)10-GC-(GT)11、(GT)10-GC-(GT)12、(GT)10-GC-(GT)13、其他形式在 13 例份HCC组织中CDC37过表达者的HCC组织中分别为 6、1、4、2、2、29、2、1、5、8、6 个克隆，在其癌旁组织中分别为 5、1、0、5、4、33、0、0、5、14、1 个克隆，在9例份HCC组织中CDC37无过表达者的HCC组织中分别为 1、0、0、1、1、2、0、1、12、5、4 个克隆。13 例肝癌组织中CDC37过表达者的HCC组织和癌旁组织中微卫星组成形式总体分布相比，P＞0.05。13例CDC37过表达者和9例无过表达者HCC组织中CDC37启动子微卫星组成形式相比，P＜0.05;其中(GT)10-GC-(GT)9形式在CDC37过表达者中所占比例高于无过表达者，两者相比，χ2=11.508、P＜0.05，(GT)10-GC-(GT)12形式在 CDC37 无过表达者中所占比例高于过表达者，两者相比，χ2=15.055、P＜0.05。

3 讨论

HCC是一种遗传与环境共同作用所致的、多基因参与的疾病，HBV和丙型肝炎病毒的感染、含黄曲霉素B1食物的摄入及过度饮酒是HCC发生的主要危险因素［3］，但参与其肿瘤发生的分子机制尚未完全明了。近年来的肿瘤遗传学研究表明，细胞的恶性转化与其遗传物质(基因组)的不稳定性有关，基因组的不稳定性主要表现为杂合性缺失和微卫星不稳定(MSI)。

微卫星序列广泛存在于真核和原核生物的基因组中，可定位于基因的启动子、内含子及外显子等区域，它可引起启动子区DNA二级结构的改变，并导致与RNA聚合酶和转录因子的结合能力发生改变，从而影响基因的表达［4］。微卫星异常是基因组不稳定的重要分子标志，微卫星序列除了参与基因表达调控，还参与基因重排与变异、维持基因组稳定等。微卫星多态性对于肿瘤的早期诊断［5］及肿瘤类型［6］、分期与转移［7］、预后判断［8］等都有重要意义。

本研究发现，CDC37基因的启动子区存在着(GT)n串联重复序列。作为蛋白激酶特异性的辅助分子伴侣CDC37在肿瘤细胞的生长、分裂、分化过程中起关键作用，近年来已成为抗肿瘤药物研究的热点，针对CDC37及其复合物抑制剂的研究也在不断进展中［9］。如果能够明确CDC37启动子微卫星多态与其过表达及HCC发生和进展之间的关系，有助于在HCC的发展过程中进行早期诊断和干预。在本研究的整个研究群体中，其CDC37基因的启动子区(GT)n1-GC-(GT)n2微卫星形式中n1的重复次数在8～10，以10最为常见;n2重复次数为8～13，以9最为常见。(GT)n1-GC-(GT)n2最常见的形式为(GT)10-GC-(GT)9，占36.60%。在 HCC组织和癌旁组织中，(GT)n1-GC-(GT)n2的总体分布没有统计学差异，最常见的形式都是(GT)10-GC-(GT)9。CDC37过表达的HCC组织与相应癌旁组织微卫星多态性的总体分布亦无统计学差异，最常见的形式都是(GT)10-GC-(GT)9。HCC组织中CDC37过表达者和无过表达者微卫星多态性存在统计学差异，其中(GT)10-GC-(GT)9在过表达者和无过表达者中的比例分别为 43.94%和 7.41%，而(GT)10-GC-(GT)12在两者中分别占7.58%和44.44%，这两种多态性在过表达者和无过表达者中的分布都有统计学差异，这种差异是否与CDC37的表达有关有待进一步研究。

研究［10］表明，富含AC/GT的微卫星序列能形成左旋双螺旋的Z-DNA结构。AC/GT微卫星长度的变化能调控基因的表达［11］，进而影响人类的相关表型［12］。体内外研究［13］表明，血红素氧化酶-1 启动子(GT)n序列重复数目的改变可影响其转录，长的重复序列可导致低水平表达，但具体机制还不清楚。血红素氧化酶-1是一种重要的保护因子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及抗增生的作用，其启动子多态性与心血管并发症相关［14］。而CDC37基因启动子区的GT微卫星多态性是否会通过DNA二级结构的变化而影响启动子的活性，进而影响CDC37的表达，从而影响HCC的发生和发展，目前尚不清楚。本研究只对 CDC37启动子微卫星多态性与CDC37表达的相关性做初步探讨，还需要进一步扩大样本量加以研究，并通过体外实验来验证不同的微卫星形式对其启动子活性的影响，才能明确该微卫星形式与CDC37表达的关系，并进一步明确其与HBV相关HCC的相关性，为临床诊治HBV相关HCC提供理论依据。

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