小分子抗体制备技术及临床应用进展

陈丽娟，张丽华，李 杰，陈永新

自20世纪80年代以来，随着各种分子生物学技术的发展和抗体基因结构的进一步阐明，DNA重组技术开始广泛应用于抗体的改造，抗体制备技术已从多克隆抗血清、单克隆抗体发展到基因工程抗体。随着近年来各种抗体制备相关技术如噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术等的不断发展，人们可制备各种类型的小分子抗体，如Fab抗体、ScFv抗体、单域抗体等，这些抗体的分子量只有完整抗体的1／6～1／2大小，除具有分子量小，穿透性强，不与Fc受体结合等特点外，还易于在各种表达系统表达及便于操作和大量生产，已成为基因工程抗体家族的主要成员和研究热点。现对小分子抗体的制备技术及其在临床医学和疾病诊断治疗等领域应用的研究进展作一综述。

1 小分子抗体的分类

常见的小分子抗体主要包括Fab（由完整的轻链和Fd构成），Fv（由 VH 和 VL 构成），ScFv（单链抗体，VH 和 VL 之间由一连接肽连接而成），单域抗体（仅由VH组成），最小识别单位（MRU，由一个CDR组成）以及超变区多肽、双链抗体、三链抗体、微型抗体等几种类型。而目前研究比较多的是单链抗体，Fab抗体，单域抗体及双特异性抗体等。

1．1 单链抗体 在DNA水平上用一段适当的寡聚核苷酸作为连接肽（linker）将VH和VL连在一起，使之表达成为一条单一肽链，即为单链抗体（ScFv）。如ZCH－7－2F9单链抗体（ScFv2F9）的构建不仅有利于在大肠杆菌中进行基因重组操作和表达也增加了其稳定性［1］。但有时构建的ScFv其亲和力明显低于亲本抗体，并常有聚集的倾向。为改善这一不足，如在构建抗狂犬病毒的单链抗体ds－FV57时就在VH和VL之间插入了一个链间二硫键［2］，这个链内二硫键远离互补决定区（CDRS），也不会影响抗原与抗体的结合能力，所以可以广泛应用，将这一类抗体简称为dsFv。单链抗体分子量小，对肿瘤的穿透力强，可将其与药物或同位素、毒素等结合后在肿瘤的靶向治疗中发挥独特的优势，在疾病的诊断方面具有一定的价值。

1．2 Fab抗体 Fab抗体由一条完整的轻链和重链Fd段通过一个链间二硫键连接组成一个异二聚体，分子结构比较稳定，不仅保持了天然抗体分子Fv段的结构，还具有穿透力强、免疫原性低，可与多种药物及放射性同位素偶联，用作药物的导向治疗载体和显影等特点。目前已用作实验室研究工具，如构建噬菌体Fab抗体库，鉴定抗体可变区间基因的功能活性，以及观察蛋白酶抑制抗体的不同机制等［3］。在此基础上，制备的单链Fab片段（scFab）可进一步加强功能性分子的生成［4］。但Fab抗体因其双链结构在原核细胞的表达受到一定的限制，还因蛋白分子在穿过内膜和折叠时效率低下，影响其分泌性表达量，且仅有1个抗原结合位点，与抗原的亲和力低，在肿瘤诊断方面没有dsFv应用广泛。

1．3 单域抗体 由于发现有些抗体的VH区也可与抗原结合，且保持了完整抗体的特异性，称其为单域抗体（single domain antibody）。单域抗体只有完整IgG分子的1／12，相较于其他抗体分子量更小也更容易进入细胞。而近几年随着抗体制备技术的不断发展，单域抗体不仅在微生物中高表达，也能保持一定的可溶性和稳定性，所以比较适合用噬菌体展示或核糖体展示等技术制备［5］，而且制备操作简便，可用来构建效应功能和结合亲和性的抗体，具有一定的应用发展前景。

1．4 双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb） 双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，一个位点可与靶细胞表面抗原结合，另一个位点则可与载荷物如毒素、酶、细胞因子、放射毒素等耦合，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景［6，7］。

2 小分子抗体的制备

当前，常用于生产小分子抗体片段的表达系统通常有大肠杆菌（E．coli）表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统4种。它们的表达成本大致是依次递增的，但翻译后加工的精确性和准确度却是依次递减的。因为不同的小分子抗体其一级结构、理化性质和生物活性是各不相同的，所以在选择表达系统时要根据所要表达的小分子抗体的类型、性质、目的产物的表达量和纯度的要求等来选择。

2．1 大肠杆菌（E．coli）表达系统 E．coli表达系统是基因表达技术中发展最早，应用比较广泛的经典表达系统，经常用来表达Fab、ScFv等小分子抗体。E．coli生长速度快培养周期短，目的蛋白表达水平高，遗传背景也比较清楚，而且进行抗体工程研究时花费较少，所以目前被广泛使用。但是由于大肠杆菌本身的蛋白翻译后修饰加工体系相当不够完善，因此在表达外源蛋白时不能对表达产物进行修饰加工，影响了外源蛋白的活性，而且表达的外源蛋白也容易被宿主菌释放的蛋白酶降解，所以要选择合适的宿主菌，这些都限制了其的应用［8］。

2．2 酵母表达系统 酵母表达系统，既具有微生物的特点，又作为真核生物弥补了原核表达系统缺乏蛋白质翻译后加工的缺陷。目前常用的酵母表达系统有啤酒酵母（Sacharomyces cervisiae）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）等。啤酒酵母安全性高，但表达的蛋白质常超糖基化，分泌能力不强，较难实现高密度发酵。近年常用的酵母表达系统主要是毕赤酵母系统，它具有发酵密度高，分泌外源产物能力强，能翻译后修饰和糖基化修饰等优势，迄今为止已经成功表达了几百种外源蛋白［9］。人们利用毕赤酵母系统成功的从1L酵母培养基上清液中纯化得到56mg的人类BAFF scFv－Fc抗体，不但解决了大肠杆菌表达抗体时不能分泌，复性后生物活性差以及产率低等缺陷，也消除了细菌表达的抗体在临床应用时可能存在毒性的风险［10］。但毕赤酵母分子生物学的研究基础差，发酵周期长，发酵时需添加甲醇都限制了对其的使用。

2．3 昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是一类广泛应用的真核表达系统，和大多数高等真核生物相似具有翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。主要包括杆状病毒表达系统、稳定转化系统两种。而杆状病毒表达系统是目前国内外较为推崇的真核表达系统之一，主要分成两大类，一类是用于表达单个外源基因的载体，另一类是多元表达载体，用于插入并表达2个或多个外源基因。应用这一系统表达的产物具有糖基化，磷酸化等修饰，接近于天然蛋白［11］。Furuta等［12］利用杆状病毒感染夜蛾成功表达出具有活性的Fab抗体。但是杆状病毒系统无法进行连续性高表达，糖基化方式与哺乳动物存在一定差异，其功能基因组学的研究仍然比较薄弱，有关病毒晚期的高表达和调控机制等仍不够明了，所以这些问题都限制了其的应用，这还需要我们不断探索可对其进行部分改进以达到理想的效果。

2．4 哺乳动物细胞表达系统 与其他系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面接近天然的高等生物蛋白质分子。目前常用于表达蛋白的哺乳动物细胞宿主有 CHO、COS、HeLa细胞、HEK293、NSO 等，其中CHO细胞是近年来研究最多应用相对广泛的细胞系，可用于表达多种外源蛋白。有报道利用重组的CHO细胞表达外源蛋白时产量能达到10 g／L，这可用于重组蛋白的工业化生产［13］。另外COS细胞系可用来做较为快速的测定，非洲绿猴肾的Vero细胞系可用来生产流感疫苗。所以目的不同选择表达的哺乳动物细胞也不同，但哺乳动物细胞对培养环境十分敏感，营养和生长因子缺乏、缺氧、病毒感染、机械搅动以及培养压力的增加等很多因素都能诱导细胞凋亡，所以利用该系统表达时需要大规模培养动物细胞，成本较高，而且在筛选过程中比较费时也比较容易污染，这些都限制了其的应用，目前已有很多学者开始关注哺乳动物细胞的筛选研究［14］。

3 小分子抗体在临床上的应用

随着生物工程技术的发展，小分子抗体的制备越来越容易，而且小分子抗体的一系列特性决定了其在医学领域的许多方面将具有很大的应用潜力，主要表现在疾病诊断、肿瘤性疾病治疗及抗感染等方面的应用。

3．1 在疾病诊断方面的应用 随着抗体技术的不断发展，放射性标记抗体的应用越来越广泛应用于肿瘤影像和诊断中。将针对肿瘤相关抗原的特异性抗体用放射性核素标记后注入人体，随血液流达肿瘤组织，与肿瘤的相关抗原结合，从而获得肿瘤的阳性显像图称为放射免疫显像。而小分子抗体所具有的分子量小，组织穿透强，清楚快等特点决定其更适合应用于放射免疫显像，应用于肿瘤的诊断。Douguchi等［15］运用噬菌体展示技术筛选出与人小细胞肺癌细胞株H889结合的scFv，不仅可用于小细胞肺癌的早期诊断，还可以根据膜定位位置对小细胞肺癌进行影像学定位，具有很大的临床价值。而99m锝－标记的抗CEA Fab抗体片段应用于临床影像学定位已经通过美国FDA认证。目前有些研究可将一些小分子抗体片段制备成某种试剂盒或芯片用于临床检测。Matsumoto等［16］通过制备抗触珠蛋白的Fab抗体检测试剂盒来检测胰腺癌，发现通过此检测胰腺癌IV期的阳性率显著高于其他临床分期。Even－Desrumeaux等［17］还将筛选出的单域抗体制成抗体芯片，Mazzucchelli等［18］利用磁性纳米技术将重组单域蛋白A标记，均可用于检测某些肿瘤标志物。

3．2 在肿瘤导向治疗中的应用 恶性肿瘤的导向治疗，是指应用亲肿瘤特异性载体与杀伤肿瘤细胞的活性物质（化疗药物、毒素、放射性核素等）相连接，将活性物质选择性送到肿瘤部位，定向的杀伤肿瘤细胞的方法。在肿瘤治疗中，双特异性抗体可针对低水平的肿瘤相关抗原，将活性物质选择性送到肿瘤细胞。Wang等［19］制备的抗G22×I50双特异性抗体通过诱导TH1型细胞因子分泌及激活CD8T细胞，抑制CD4（＋）CD25（＋）T细胞的表达，可探索鼻咽癌中抗癌抗生素免疫机制。Kellner等［20］制备的抗 CD19×CD16 双特异性抗体，可增强B淋巴瘤细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。Tuscano 等［21］构建抗 CD20×CD22 双特异性抗体可用于治疗淋巴细胞瘤。此外，也可将制备的人源小分子抗体直接用于肿瘤的诊断治疗。

3．3 小分子抗体的抗感染作用 目前人类最常利用疫苗和抗生素来预防和治疗感染性疾病，但对于SARS、AIDS等疾病，目前还未发现有效的治疗方法，但可选用抗体治疗作为首选方案。如Shen等［22］已成功构建了针对特异性细胞株的Fab噬菌体抗体库。Hartono等［23］则研究比较了HK20Fab和D5Fab分别与HIV－1gp41结合的亲和力以抑制病毒和细胞膜的结合，这些对于SARS的预防、诊断和治疗将奠定一定的基础。对于一些其他的感染性疾病，Chen等［24］制备的Fab091抗体已经证实可以中和狂犬病病毒，它可以和单克隆抗体一样在未来的研究中作为接触狂病病毒的预防措施。

此外，小分子抗体还可用作酶标抗体、用于临床诊断和肿瘤影像分析等。将单链抗体同酶、蛋白质的基因连在一起，构建成复合功能抗体基因，通过成熟表达和纯化技术直接分离出用于临床诊断的酶标抗体，使诊断更为方便、快速、更适合于临床应用。

4 展 望

近年来，有关小分子抗体的研究进展迅速，在基础理论研究和临床应用方面都取得了一定的效果。目前通过基因工程抗体技术制备的小分子抗体在疾病诊断、肿瘤性疾病治疗、抗感染以及放射显像等方面均得到了广泛的应用。但是，制备的小分子抗体在产量、亲和性、稳定性等方面尚未达到临床应用的要求，抗体的免疫原性仍然是临床治疗的主要障碍，如何得到足够数量及质量的小分子抗体在技术上仍是一个未解决的问题。因此，如何提高其表达产量，增强其稳定性和特异性，提高临床应用的有效性及可靠性，仍需做大量深入的研究和临床试验。相信随着抗体技术的不断发展和基础研究的不断深入，小分子抗体在临床疾病诊治中的应用将会更广泛。

［1］ Ning BT，Tang YM，Cao J，et al．Construction and expression of prokaryotic vector of single chain antibody derived from a new clone of anti－CD14 antibody ZCH－7－2F9［J］．Zhejiang Da Xue Xue Bao，2008，37（1）：51－9．

［2］ Duan Y，Gu TJ，Jiang CL，et al．A novel disulfide－stabilized single－chain variable antibody fragment against rabies virus G protein with enhanced in vivo neutralizing potency［J］．Mol Immunol，2012，51（2）：188－96．

［3］ Yan Wu，Charles Eigenbrot，Wei－Ching Liang，et al．Structural insight into district mechanisms of protease inhibition by antibodies［J］．PNAS，2007，104（50）：19784－19789．

［4］ Hust M，Jostock T，Menzel C，et al．Single chain Fab（scFab）fragment［J］．BMC Biotechnology，2007，7（14）：1472－6750．

［5］ Harmsen MM，De Haard HJ．Properties production and applications of camelid single－domain antibody fragments［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2007，77（1）：13－22．

［6］ Booy EP，Johar D，Maddika S．Monoclonal and bispecific antibodies as novel therapeutics［J］．Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2006，54（2）：85－101．

［7］ Sarkar S，Tang XL，Das D，et al．A bispecific antibody based assay shows potential for detecting tuberculosis in resource constrained laboratory settings［J］．PLoS One，2012，7（2）：e32340．

［8］ DENG Chun－mei，GE Yu－qiang，LIU L，et al．Progress on the expression system of exogenous gene［J］．Progression Modern Biomedicine，2010，10（19）：3744－3746．

［9］ Hang HF，Ye XH，Guo MJ，et al．A simple fermentation strategy for high－level production of recombinant phytase by Pichia Pastoris using glucoseas the growth substrate［J］．Enzyme and Microbialogy Technology，2009，44（4）：185－188

［10］ Ren F，Li BC，Zhang NN，et al．Expression，purification and characterization of anti－BAFF antibody secreted from the yeast Pichia pastoris［J］．Biotechnology Letters，2008，30（6）：1075－1080

［11］ Olczak M，Olczak T．Comparison of different signal peptides for protein secretion in nonlytic insect cell system［J］．Anal Biochem，2006，359（1）：45－53．

［12］ Furuta T，Ogawa T，Katsuda，et al．Efficient production of an antibody Fab fragment using the baculovirus－insect cell system［J］．J Biosci Bioeng，2010，110（5）：577－81．

［13］ Kim JY，Kim YG，Lee GM．CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins：current state and further potential［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（3）：917－30．

［14］ Browne SM，Al－Rubeai M．Selection methods for high－producing mammalian cell lines［J］．Trends Biotechnol，2007，25（4）：425－32．

［15］ Douguchi J，Hashiguchi A，Sakamoto M．Construction of human monoclonal single－chain Fv antibodies against small－cell lung cancer by phage display libraries derived from cell－immunized SCID mice engrafted with human peripheral blood lymphocytes［J］．Proteomics Clin Appl，2009，3（11）：1265－1272．

［16］ Matsumoto H，Shinzaki S，Narisada M，et al．Clinical application of a lectin－antibody ELISA to measure fucosylated haptoglobin in sera of patients with pancreatic cancer［J］．Clin Chem Lab Med，2010，48（4）：505－512．

［17］ Even－Desrumeaux K，Baty D，Chames P．Strong and oriented immobilization of single domain antibodies from crude bacterial lysates for high－throughput compatible cost－effective antibody array generation［J］．Mol Biosyst，2010，6（11）：2241－2248．

［18］ Mazzucchelli S，Colombo M，De Palma C，et al．Single－domain protein A－engineered magnetic nanoparticles： toward a universal strategy to site－specific labeling of antibodies for targeted detection of tumor cells［J］．ACS Nano，2010，4（10）：5693－5702．

［19］ Wang J，Li Y，Li Yi，et al．In vitro anti－tumor immune mechanism of nasopharyngeal carcinoma bispecific anti－idiotype antibody［J］．Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，35（8）：777－783．

［20］ Kellner C，Bruenke J，Horner H，et al．Heterodimeric bispecific antibody－derivatives against CD19 and CD16 induce effective antibody－dependent cellular cytotoxicity against B－lymphoid tumor cells［J］．Cancer Lett，2011，303（2）：128－139．

［21］ Tuscano JM，Ma Y，Martin SM，et al．The Bs20x22 anti－CD20－CD22 bispecific antibody has more lymphomacidal activity than do the parent antibodies alone［J］．Cancer Immunol Immunother，2011，60（6）：771－80．

［22］ Shen YM，Yang XC，Dong NZ，et al．Generation，screening and preliminary identification of specific Fab phage antibody library against Daudi cell strain［J］．Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2009，25（2）：150－4．

［23］ Hartono YD，Lazim R，Yip YM，et al．Computational study of bindings of HK20 Fab and D5 Fab to HIV－1gp41［J］．Bioorg Med Chem Lett，2012，22（4）：1695－700．

［24］ Chen LI，Feng ZHANG，Hong LIN，et al．Generation and characterization of the humanneutralizing antibody fragment Fab091 against rabies virus［J］．Acta Pharmacologica Sinica，2011，32（3）：329－337．