盐酸小檗碱对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶含量及活性的影响

谭文超

0 引言

盐酸小檗碱，又名黄连素，广泛存在于小檗科等4科10属的许多植物中。该药具有明显的抗炎作用。对痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌等有明显的抑制作用。近年的研究还发现，盐酸小檗碱具有抗心律失常、高血脂、高血压的作用和体外抗肿瘤活性[1-2]。该药在临床上主要用于肠道感染及菌痢等的治疗。近年来，该药与其他药物的联合应用越来越多，如与大蒜素、氧氟沙星等联合用于细菌性痢疾的治疗[3]，与奥美拉唑和阿莫西林联合用于幽门螺旋杆菌的根除[4]。有研究显示，盐酸小檗碱可能抑制氟西汀经CYP3A4代谢，从而诱发5-HT综合征[5]。还有多项研究报道，盐酸小檗碱可以增加环孢素A的血药浓度[6-7]。

细胞色素P450(CYP450)酶是一个结构和功能相关的同工酶组成的超家族酶系，大多数药物在体内通过CYP450酶系代谢[8]。许多药物对CYP450酶可产生抑制或诱导作用，进而影响CYP450酶的量和活性，导致联合用药后药物间产生相互作用，从而使疗效降低或毒性增加[9-10]。因此，了解药物对CYP450的影响对临床联合用药的安全性和合理性有着十分重要的指导意义。

本研究在体外采用特异性探针底物(异喹胍、非那西丁、美芬妥英和咪达唑仑)结合高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)，研究了盐酸小檗碱对大鼠肝微粒体的蛋白含量、CYP450酶总量和主要CYP450酶亚型(CYP2D6、CYP1A2、CYP2C19和CYP3A4)活性的影响，旨在为盐酸小檗碱类药物合理、安全的联合用药提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 动物 Wistar大鼠，体重200～220 g，购自中国医科大学动物实验研究中心。

1.2 主要药品与试剂 盐酸小檗碱，购自湖北拓楚慷元医药有限公司；异喹胍、4-羟基异喹胍、非那西丁、1-羟基咪达唑仑、美芬妥英和4-羟基美芬妥英购自Sigma公司；对乙酰氨基酚对照品、5-溴尿嘧啶对照品和盐酸纳洛酮对照品，购自中国药品与生物制品检定所；咪达唑仑，购自徐州恩华药业集团有限责任公司；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，进口分装，购自北京鼎国生物技术有限公司；牛血清白蛋白，西德进口分装，购自上海市浦江应用生物化学研究所。甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国Fisher公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 TSQ Quantum Access液相色谱质谱联用仪(美国Thermo scientific公司)；UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)。

2 方法

2.1 给药方案 健康Wistar大鼠18只，随机分成3组，每组6只，雌雄各半。苯巴比妥诱导组，腹腔注射苯巴比妥钠75 mg/kg；空白对照组，腹腔注射相同体积生理盐水；盐酸小檗碱给药组，灌胃给予盐酸小檗碱250 mg/(kg·d)。连续7 d。

2.2 肝微粒体的制备 实验前动物禁食24 h。动物拉颈处死，开腹取出肝脏，用滤纸吸干水分，称重；立即放于冰冷的蔗糖溶液中清洗，用剪刀剪碎，反复清洗至无血色；加4倍肝重的蔗糖溶液，在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆，超声分散30 s；4 ℃下20 000×g离心20 min；弃去沉淀，上清液在4 ℃下100 000×g离心60 min；弃去上清液，沉淀用焦磷酸钾缓冲液悬浮均匀，在4 ℃下100 000×g离心60 min，沉淀即为肝微粒体，用Tris-HCl缓冲液悬浮均匀，分装，于-80 ℃保存。

2.3 蛋白浓度测定 采用Folin-酚法测定蛋白含量[8]。得到的蛋白浓度标准曲线为C=0.001 5 A，r=0.998。取肝微粒体样品用0.5 mol/L NaOH稀释适当倍数，使其响应在标准曲线的响应范围内，同法测定，以同体积的Tris-HCl缓冲液代替肝微粒体样品作为空白对照，根据标准曲线计算蛋白浓度。

2.4 CYP450含量测定 根据Wang等[9]报道的方法测定肝微粒体样品中CYP450的含量。将肝微粒体样品用Tris-HCl缓冲液稀释至0.4 mg/mL JP，分别取2.5 mL放于样品池和参比池中；各加入少量Na2S2O4，并轻微搅拌，对样品池通一氧化碳(CO)气体30 s，扫描，分别记录在450 nm和490 nm处的吸收度，然后根据Beer定律计算CYP450的含量。

CYP450(nmol/mg protein)=A(450-490)×1 000/91×C

其中，A(450-490)为450 nm和490 nm的吸收度之差，C为被测样品的蛋白浓度(mg/mL)，CYP450-CO结合物的摩尔消光系数为91 L/(mmol·cm)。双样本测定，计算平均值。

2.5 CYP450酶活性测定

2.5.1 肝微粒孵化 孵化反应体系中分别含有0.5 mg大鼠肝微粒体蛋白、5.0 μmoL MgCl2、5.0 μmoL KCl及100 nmoL的特异性底物，以0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)定容至450 μL，于37 ℃预孵2 min后，加入50 μL NADPH(终浓度为1.0 mmol/L)启动反应。孵育一定时间后取100 μL反应液用100 μL冰冷甲醇终止反应。各种CYP450酶的特异性探针底物和特异性产物以及孵育时间如表1所示。

2.5.2 代谢产物测定 采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法对生成的特异性代谢产物进行定量分析。每天制备标准曲线，根据标准曲线计算未知样品的浓度。在样品测试过程中随行低、中、高3个浓度的QC样品，QC样品的总数不低于该批样品总数的5%，QC样品的计算浓度不得超出其理论值的15%，否则此批数据将不被接受。各特异性产物的LC-MS/MS测定条件如表2所示。

表1 各种CYP450酶的特异性探针底物及孵育时间

3 结果

3.1 盐酸小檗碱对大鼠肝微粒体蛋白和CYP450含量的影响 大鼠肝微粒体蛋白和CYP450含量如表3所示。与空白对照相比，连续口服给药7 d后，盐酸小檗碱对大鼠肝微粒体蛋白含量和CYP450含量没有影响。

表2 各探针底物色谱分析条件

表3 盐酸小檗碱对大鼠肝微粒体蛋白和CYP450含量的影响

3.2 盐酸小檗碱对肝微粒体CYP2D6、CYP1A2、CYP2C19和CYP3A4活性的影响 见表4。由表4可见，与空白对照组比较，口服给药7 d后，盐酸小檗碱给药组的CYP3A4酶活性明显降低(P<0.05)，单位时间内生成的特异性产物的量是空白对照组的1/2(114.2 vs 218.6)，而CYP2D6、CYP1A2及CYP2C19酶的活性在空白对照组与给药组之间无显著意义，并且两组的值均明显低于苯巴比妥给药组。

表4 盐酸小檗碱对大鼠CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4和CYP2C19活性的影响

4 讨论

本研究分别利用特异性探针药物非那西丁、异喹胍、咪达唑仑、美芬妥英，通过比较对照组与给药组代谢产物的生成速度评价盐酸小檗碱对CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4及CYP2C19活性的影响，本方法结合LC-MS/MS的快速、高速分离与多探针底物的特异性，适用于研究药物对CYP450酶活性的影响。此外，本研究选用经典的肝微粒体酶诱导剂苯巴比妥作为阳性对照。从实验结果可见，苯巴比妥诱导组CYP450蛋白含量和活性明显高于空白对照组，也证明本实验中肝微粒体制备方法能够获得有活性的肝微粒酶。

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