氟伐他汀对尼古丁诱导血管内皮功能障碍的保护作用

胡翠竹，蔡冬梅，胡 健

0 引言

目前全球范围内吸烟引起的死亡率逐年升高。流行病学调查研究已经证实，吸烟是诸多心血管病危险因素中动脉粥样硬化(AS)的独立危险因素[1]，烟雾中的尼古丁(Nicotine)是引起心血管疾病的主要物质之一。尼古丁可降低HDL-C水平，并使LDL-C增加，减弱血管内皮细胞的屏障功能，诱发并加速AS的发生和发展。尼古丁可通过核转录因子-κB(NF-κB)途径诱导细胞粘附分子的表达，引起内皮细胞功能紊乱，诱发并加速AS的发生和发展[2]。

氟伐他汀是一个全合成的他汀药物，为羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，作用于肝脏，具有抑制内源性胆固醇的合成，降低肝细胞内胆固醇的含量，刺激LDL受体的合成，提高LDL微粒摄取，降低血浆总胆固醇浓度的作用[3]。众多试验证实他汀类药物可以保护血管内皮细胞功能，延缓AS进展，明显改善冠心病的预后，减少心脑血管疾病的终点事件[4-8]。

本实验拟观察尼古丁对血管内皮细胞白介素-8(Interleukin-8，IL-8)表达变化的影响，通过尼古丁诱导血管内皮细胞功能障碍，并观察氟伐他汀对这一过程的影响，探讨氟伐他汀是否会影响尼古丁诱导的血管内皮细胞功能紊乱，以及氟伐他汀改善尼古丁引起内皮细胞功能紊乱致AS作用的相关机制。

1 材料和方法

1.1 试剂 DMEM培养基(Sigma公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；尼古丁(中国医科大学发育生物教研室翟秀岩老师惠赠)；NF-κB抑制剂PDTC(Sigma公司)；NF-κB活性检测试剂盒(Active Motif 公司)；IL-8 ELISA检测试剂盒(吉泰生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养及细胞分组 HUVEC株CRL-1730购自于上海拜力生物科技有限公司。细胞培养基为含有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养液；培养条件为5%的CO2，37 ℃；0.25%胰蛋白酶消化传代，将传代生长至80%融合状态时的内皮细胞用无血清的DMEM培养液饥饿16 h后同步用于实验。分为4组：①空白对照组：无血清培养基替代处理因素；②尼古丁组：100 nmol/L 尼古丁孵育内皮细胞24 h；③氟伐他汀组：10-5mol/L氟伐他汀孵育内皮细胞1 h后，100 nmol/L 尼古丁孵育内皮细胞24 h；④NF-κB抑制剂组：100 μmol/L PDTC和100 nmol/L 尼古丁孵育内皮细胞24 h，收集细胞标本及培养液。

1.3 IL-8蛋白的定量检测 收集的细胞培养液离心 2 000×g，10 min，除去悬浮的细胞和颗粒，收集上清，储存于-20 ℃待测IL-8水平。ELISA测定步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4 细胞NF-κB的活性 收集细胞后按照TransAM(tm)NF-κBp50检测试剂盒说明书进行，检测细胞NF-κB的活性，以对照组的数值为1进行半定量分析。

2 结果

2.1 氟伐他汀对尼古丁诱导血管内皮细胞NF-κB活性的影响 尼古丁组NF-κB活性较空白对照组明显升高(P<0.05)；氟伐他汀组NF-κB活性较尼古丁组显著下降(1.26±0.12 vs 2.95±0.17，n=3，P<0.05)。见图1。

图1 内皮细胞NF-κB活性的组间比较

2.2 氟伐他汀对尼古丁诱导血管内皮细胞IL-8表达的影响 NF-κB抑制剂组较尼古丁组IL-8的蛋白表达明显下降(1.01±0.12 vs 7.03±0.22，n=3，P<0.05)，氟伐他汀组较尼古丁组IL-8的蛋白表达明显下降(1.45±0.11 vs 7.03±0.22，P<0.05)，见图2。

图2 内皮细胞培养液中IL-8蛋白表达的组间比较

3 讨论

流行病学研究表明，吸烟是心脑血管疾病、癌症、慢性阻塞性肺疾病等多种疾病的独立危险因素[9-11]，全球每年有500万人死于与吸烟有关的疾病，长期吸烟者的心血管疾病发病率比普通人群高2～3倍。香烟烟雾中对人体危害最大的物质之一是尼古丁，长期摄入尼古丁后肺癌、胃溃疡、冠心病、高血压等疾病的发病率增加，尤其是尼古丁与心脑血管系统疾病如高血压、高血脂、冠心病、脑卒中等疾病关系密切[12]。血管内皮细胞功能障碍是AS发生发展的始动环节。早期实验观察到，吸烟个体中出现血管内皮细胞肿胀、胞浆空泡形成、细胞连接疏松出现、线粒体水肿、内皮细胞下水肿等形态学变化。尼古丁可引起内皮细胞相同的形态学改变，并导致内皮细胞渗透性增加；亦可诱导内皮细胞粘附分子ICAM-1及VCAM-1 的表达[13-14]。

IL-8 属于CXC 类趋化因子，诱发单核细胞的聚集和粘附，在AS的发生发展中起重要作用。NF-κB属于NF-κB/Rel家族，主要是由p50/p65组成的异源二聚体，是一种多极性基因调控蛋白。与内皮细胞活化有关的各种刺激可通过活化NF-κB起作用。近年研究结果显示，尼古丁可使内毒素刺激下的人肺泡巨噬细胞MAPK磷酸化、IL-8表达增加；体内研究证实，尼古丁可通过N-乙酰胆碱能受体，刺激产生过氧化亚硝酸盐，继而活化NF-κB，从而升高中性粒细胞IL-8的表达，引起吸烟个体的白细胞增多症。本实验观察了尼古丁对人脐静脉内皮细胞IL-8表达的影响，结果显示，尼古丁组人脐静脉内皮细胞IL-8的表达较空白对照组明显升高，同时NF-κB活性升高，并且NF-κB特异性抑制剂可阻断尼古丁诱导的IL-8的表达。本研究结果表明，尼古丁可通过触发NF-κB的活化，从而诱导IL-8的表达，在AS的发生和发展中起重要作用。

氟伐他汀钠可降低LDL-C水平，改善内皮细胞功能，防止AS的进展[15]。本实验结果显示，氟伐他汀组NF-κB的活性较尼古丁组明显抑制；本实验结果已经证实，尼古丁可通过激活人脐静脉内皮细胞NF-κB的活性，从而诱导IL-8的表达；氟伐他汀可拮抗尼古丁诱发的NF-κB的活化，抑制尼古丁诱导的IL-8的表达，提示氟伐他汀可能通过抑制尼古丁诱导的NF-κB活化，从而抑制尼古丁诱导的IL-8的表达。本实验证实，氟伐他汀可通过抑制尼古丁诱导的NF-κB的活化，抑制尼古丁诱导的趋化因子的表达，为氟伐他汀改善吸烟患者内皮细胞功能提供新的理论依据。

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