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TLR4-p38MAPK信号通路在金黄色葡萄球菌感染人巨噬细胞系U937过程中的表达及意义

2014-08-15王佳贺岳冬梅

实用药物与临床 2014年11期
关键词:信号转导金黄色葡萄球菌

王佳贺,岳冬梅,何 平*

0 引言

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌,Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起医院和社区获得性感染最常见的革兰阳性致病菌[1-3]。研究表明,外界刺激因子对免疫细胞行为的调解主要与细胞内多条信号传导通路的活化有关[4]。金黄色葡萄球菌感染后,通过Toll 样受体(TLR)的识别引起炎症反应,但其信号通路尚未完全阐明。本实验在原有的工作基础之上,通过金黄色葡萄球菌感染人巨噬细胞系U937细胞,研究金黄色葡萄球菌对单核巨噬细胞表面TLR4的活化作用;并给予特异性 p38 蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的抑制剂,探讨针对p38MAPK的干预对TLR4和p38MAPK蛋白表达的影响,观察TLR4-p38MAPK信号通路的变化,对 TLR4-p38MAPK信号传导机制与金黄色葡萄球菌感染的关系进行初步探讨,为金黄色葡萄球菌所致疾病的治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器 细胞培养试剂购自美国Invitrogen公司;p38MAPK 特异性抑制剂SB203580(CalBiochem公司),以二甲基亚砜(DMSO)溶解,使用前以生理盐水稀释,使DMSO 的终浓度为2%,SB203580 的终浓度为5 mg/mL或10 mg/mL;其他所有试剂均购自美国Sigma公司,离心机购自德国Eppendorf 公司;流式细胞仪购自美国Backman公司。

1.2 细胞培养 U937细胞在37 ℃、体积分数5%CO2、100%湿度的条件下,于含有体积分数10%胎牛血清的RPMI(Roswell park memorial Institute)-1640培养液中进行培养。每2~3天更换新鲜培养液,待细胞在培养瓶约90%时,用培养液将其稀释3倍,分瓶继续培养。

1.3 细菌培养 将冻存于甘油中的金黄色葡萄球菌Wood46按照1∶100的比例接种于CYGP培养基中,37 ℃摇床过夜活化。在金黄色葡萄球菌感染U937细胞0、30、60 和90 min后收集细胞。

1.4 Western blot 检测TLR4和p38MAPK蛋白的表达 人外周血单核细胞处理一定时间后,用磷酸盐缓冲液洗涤3次,沉淀物在冰上用裂解液重悬20 min。等量蛋白用体积分数12%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过电转仪将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜,转膜时间为2 h。质量分数2%脱脂奶粉室温封闭1 h;用TLR4,磷酸化p38MAPK,非磷酸化p38MAPK蛋白等一抗,4 ℃孵育过夜;磷酸盐缓冲液漂洗3次后加二抗,室温孵育2 h;化学发光法显色,并进行扫描分析,同一实验重复3次。

1.5 统计学处理 每组实验均重复3次,采用SPSS 10.0 统计学软件进行统计学处理,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间比较用最小显著差法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌Wood46刺激后可以活化U937细胞中TLR4-p38MAPK信号通路 结果显示,TLR4和p-p38MAPK表达于U937细胞上,见图1。金黄色葡萄球菌Wood46感染后,TLR4和p-p38MAPK的表达水平随着感染时间的延长而增加,表明在U937细胞中金葡菌Wood46可以活化TLR4-p38MAPK信号通路。

2.2 P38MAPK信号通路在金黄色葡萄球菌Wood46诱导U937细胞表达TLR4和p-p38MAPK的过程中起着重要作用:当SB203580的浓度分别为5 mg/mL或10 mg/mL时,可以显著下调TLR4的表达和p-p38MAPK的磷酸化水平(图 2)。

图1 金黄色葡萄球菌Wood46诱导U937细胞中TLR4和p-p38MAPK的表达上调

图2 特异性p38MAPK抑制剂对金黄色葡萄球菌Wood46诱导活化TLR4和p-p38MAPK通路的影响

3 讨论

近年来,随着病原菌与宿主免疫细胞相互作用研究的深入,能够介导细菌毒力因子抑制或活化宿主细胞内信号分子的细胞表面蛋白日渐成为研究者关注的热点。TLRs是新近发现的天然免疫的病原识别受体。它们可以通过广泛地特异性识别病原微生物,偶联信号传导途径,并激活天然免疫细胞,最终导致一系列的免疫炎症反应[5]。TLRs 主要经以下两条信号传导途径:TLRs-髓系分化蛋白(MyD88)/白细胞介素-1(IL-1)-受体相关激酶(IRAK)-核因子-κB(NF-κB)诱导激酶(NIK)/NF-κB 途径;TLRs-MyD88/IRAK-丝裂原活化激酶途径[5-7]。其中TLR4 是第一个被发现的哺乳动物TLR,是最具代表性的TLRs受体。研究表明,TLR4 的活化可激活一系列的信号转导通路,如MAPKs 家族。MAPK级联是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,是细胞内的主要信息传递系统,可将细胞外信息传递到细胞核中,其中,p38MAPK通路是介导炎症发生的主要信号转导通路之一[8-11]。

以往的研究发现,金黄色葡萄球菌α-毒素可诱导人单核细胞凋亡,增加 TLR2和 TLR4的表达,在金黄色葡萄球菌的致病过程中起重要作用;我们用α-毒素蛋白纯品作用于单核细胞,结果显示,α-毒素能够增加c-jun和c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK1/2)、p38MAPK的磷酸化水平,证明了MAPK信号通路的成员p38 MAPK和JNK1/2在金黄色葡萄球菌α-毒素的致病过程中起重要作用[12-13]。

本实验中,我们用含有α-毒素的金黄色葡萄球菌菌株Wood46感染人巨噬细胞系U937细胞,发现可引起TLR4和p-p38MAPK蛋白表达明显增高;同时也证明TLR4-p38MAPK信号通路在金黄色葡萄球菌感染的信号传导中起着重要作用。同时,我们用特异性抑制剂SB203580进行干预,相应地影响TLR4蛋白的表达以及p-p38MAPK蛋白的表达,进一步证明了TLR4-p38MAPK信号转导途径与金黄色葡萄球菌感染密切相关。

综上所述,TLR4-p38MAPK信号转导途径参与了金黄色葡萄球菌感染过程,p38MAPK在信号转导过程中起着重要作用,针对控制TLR4-p38MAPK通路可能成为临床上防治金黄色葡萄球菌感染的一个新思路。

参考文献:

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