LC-MS法测定大鼠血浆中EXH-1626的浓度及其药代动力学研究

李泰平，肖 红，向 华

0 引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来，乳腺癌发病正日渐年轻化，已严重影响妇女的身心健康及生命安全，因此，研制有效安全、毒副作用小的新型抗乳腺癌药物显得尤为迫切。EXH-1626是中国药科大学药物化学教研室合成的一种新型6-芳基茚并异喹啉酮衍生物，药效学研究表明其可以用于治疗乳腺癌，其分子式为C29H28N2O3。茚并异喹啉酮类化合物是美国国立癌症研究中心(NCI)通过COMPARE系统比较筛选而得到的一类新型拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，与喜树碱类化合物相比，茚并异喹啉酮类化合物没有内酯环，因而在体内表现出更好的化学稳定性[1]。关于EXH-1626在生物样品中的测定方法的文献报道较少[2]，本试验旨在建立一种测定速度快、准确度高、可操作性强的液相色谱-质谱法，并应用于EXH-1626的大鼠体内药代动力学研究，为其非临床药代动力学研究提供参考。

1 材料

1.1 药品与试剂 EXH-1626盐酸盐标准品(由中国药科大学药物化学教研室提供，批号：20100927，纯度99.2%)；卡马西平(中国药品生物制品检定所，0142-9503)；纯净水(杭州娃哈哈纯净水公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，TEDIA公司)；蛋白沉淀剂(甲醇∶5%硫酸锌=70∶30，V/V)；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器 Agilent 6410型三重四级杆质谱联用仪与1200型液相色谱系统，均为美国Agilent公司产品，包括ESI离子化源，MassHunter B.03.01(数据采集与定性)和MassHunter B.04.00(数据分析)处理软件，Binary SL四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器以及柱控温箱。

2 方法

2.1 实验条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱为ODS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，汉邦公司；流动相为乙腈-10 mmol/L醋酸铵水溶液(乙酸调pH至3)(70∶30)；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI)；SIM检测方式；干燥气温度为350 ℃；干燥气流速为10 L/min；毛细管电压4 000 V；雾化器压力为40 psi；定量分析的离子[M+H]+分别为m/z 453.3(EXH-1626)，碰撞能160 V；m/z 237.1(内标)，碰撞能130 V；扫描时间为20 ms。

2.2 标准溶液的配制

2.2.1 EXH-1626标准溶液的配制 精密称取EXH-1626标准品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，得1.0 mg/mL贮备液，然后依次加水稀释配成100 000、50 000、10 000、5 000、1 000、500、200、100和50 ng/mL EXH-1626标准溶液，4 ℃保存备用。

2.2.2 卡马西平内标溶液的配制 精密称取5.8 mg卡马西平于100 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，即配制成58 mg/mL卡马西平储备液。取一定量的卡马西平储备液，用流动相稀释至100 μg/mL作为内标溶液，4 ℃保存备用。

2.2.3 标准血样的制备 取离心管数支，分别精密加入不同量的EXH-1626标准液后以氮气流吹干，加入空白血浆200 μL，涡旋1 min，配成血浆中含EXH-1626分别为5、10、20、50、100、500、1 000、5 000和10 000 ng/mL的标准系列浓度，同法依次配成血浆中含EXH-1626分别为10、100、1 000和10 000 ng/mL的由低到高浓度的质量控制(QC)血样。

2.3 血浆样品的处理 精密量取血浆样品200 μL于空白离心管中，精密加入10 μL内标溶液(100 μg/mL)，涡旋混匀后再精密加入蛋白沉淀剂200 μL，涡旋1 min，混匀后离心(12 000 r/min) 10 min，吸取上清液至分析小瓶中，进样5 μL分析。

2.4 药代动力学 Sprague-Dawley大鼠16只，清洁级，体重(200±20) g，由南京医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(苏)2008-0004。随机分4组，每组4只，雌雄各半。实验前禁食12 h，自由饮水。口服实验，取两组大鼠称重后按80和250 mg/kg的剂量灌胃给予EXH-1626混悬溶液(用纯净水配制)，于给药前以及给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h，由大鼠断尾采血0.4 mL。静脉实验，另取两组大鼠按10和20 mg/kg剂量尾静脉注射给予EXH-1626葡萄糖溶液(用5%葡萄糖溶液配制并灭菌处理)，于给药前及给药后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48和72 h，由大鼠断尾取血0.4 mL左右。血样均置于预先肝素化的试管中，经12 000 r/min离心10 min后分离血浆，-20 ℃保存待测。所得的血药浓度时间数据应用中国药科大学生物利用度研究数据处理通用程序BAPP2.2软件计算EXH-1626的药代动力学参数。

3 结果

3.1 方法的专属性 在本实验所采用的条件下，EXH-1626和内标的保留时间分别为2.9和3.5 min左右。如图1所示，EXH-1626和内标峰形良好，能有效分离，无杂峰干扰测定，专属性良好，血浆中内源性物质不干扰EXH-1626和内标的测定。EXH-1626及内标的一级扫描质谱图，见图2。

图1 空白血浆、EXH-1626及卡马西平的典型色谱图

图2 EXH-1626(A)及内标(B)的一级扫描质谱图

3.2 线性范围和定量限 按“2.2.3”项下操作配制系列血药浓度为5、10、20、50、100、500、1 000、5 000和10 000 ng/mL的样品，按“2.3”项下操作，进样分析，建立EXH-1626的标准曲线。EXH-1626浓度(ng/mL)为纵坐标，以y表示，EXH-1626峰面积(As)与内标峰面积(Ai)的比值(As/Ai)为横坐标，以x表示，线性回归计算得回归方程为y=101.13x-34.55(r=0.999 7，权重系数为1/c2)，EXH-1626血浆浓度在5～10 000 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限浓度为5 ng/mL(S/N>10)。

3.3 精密度实验 以空白血浆配制由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4个不同浓度的EXH-1626 QC样品，每一浓度进行5份样本分析，连续测定3 d，并与标准曲线同时进行，根据当日的标准曲线计算QC样品的浓度，将QC样品的结果进行分析，结果显示，由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4个不同浓度的日内、日间精密度分别为8.7%、4.4%、4.3%、1.1%和7.4%、4.1%、4.0%、1.4%，符合生物样品分析方法的要求。

3.4 回收率实验 以空白血浆配制由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4个不同质量浓度的EXH-1626 QC样品，每一浓度各5份样本，按“2.3”项下操作，计算并记录EXH-1626与内标峰面积之比(a)，由相应的标准曲线计算浓度，该浓度与加入的浓度之比为相对回收率。同时以流动相代替空白血浆，同法计算提取回收率。结果显示，由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4个浓度的相对回收率和绝对回收率分别为108.1%、106.5%、103.6%、99.7%和72.5%、76.3%、78.4%、76.6%，符合生物样品分析要求。

3.5 稳定性实验 取离心管数支，制备由低到高(10、100、1 000和10 000 ng/mL)4个不同浓度的血浆样本各5份，1份制备好后按“2.3”项下操作，立即进样分析；1份室温下放置6 h；1份血样冰箱中(4 ℃)放置12 h后同法操作；1份于冰箱中(-20 ℃)冷冻保存15 d后取出化冻；1份在1个月内反复冻融3次，然后同法操作。结果各浓度样本测定值的偏差均小于10%，结果表明，样品在上述条件下稳定性良好。

3.6 药代动力学研究结果 大鼠以80 mg/kg剂量口服EXH-1626后0.5 h，在血中均可测到其浓度，药时曲线有双峰现象，给药后3和6 h达到浓度峰值。实验数据经BAPP软件分别以单室和双室模型处理，计算主要药代动力学参数，比较AIC、r2、Re三个值，以r2值最大确定其为单室模型(权重系数为1)。而以250 mg/kg剂量口服给药后于2、8、48和120 h重复达到浓度峰值，见图3，实验数据经BAPP软件不能很好拟合处理，两组主要药代动力学参数见表1。

图3 大鼠口服给药药时曲线

表1 大鼠口服给药后药代动力学参数(权重系数为

大鼠尾静脉注射后，分布很快，见图4。其主要药代动力学参数见表2。实验数据分别以单室和双室模型处理，比较AIC、r2、Re三个值，以r2值最大确定其为单室模型(权重系数为1)。

图4 大鼠静脉注射给药后的药时曲线

大鼠口服给药的绝对生物利用度采用公式计算：

其中AUCi.v.和AUCt分别为尾静脉注射和口服条件下的AUC、Xiv和Xt分别为尾静脉注射和口服的药物剂量。由上述数据经计算可得，口服给予80和250 mg/kg剂量下绝对生物利用度分别为14.14%和21.74%。

表2 大鼠静脉给药后的主要药动学参数(权重系数为

4 讨论

4.1 流动相及内标的选择 在流动相选择方面，笔者研究比较了甲醇、乙腈、醋酸和三乙胺水溶液的不同浓度、有机相与水相的不同构成比及流动相的不同pH值对分析结果的影响，最后选择乙腈-0.01 mol/L醋酸铵水溶液(用乙酸调pH至3)(70∶30)为流动相，在此条件下，EXH-1626和内标的保留时间分别为2.9和3.5 min，目标化合物峰形良好。

内标的选择既要考虑质谱的响应与待测物的匹配性，又要兼顾其不与EXH-1626药物及蛋白沉淀剂发生反应。实验中曾筛选了多个化合物，如甲硝唑、地西泮等，发现在本实验条件下，由于保留时间较长或者干扰目标峰而放弃，选用卡马西平为内标，它不仅稳定性好，对待测物和沉淀剂稳定，与色谱柱亲和力适中，保留时间合适。

4.2 血浆样品的前处理 本文采用蛋白沉淀法进行血样处理，所应用的蛋白沉淀剂由甲醇和5%硫酸锌溶液(体积比为70∶30)组成，用此蛋白沉淀剂直接沉淀血浆中的蛋白，不仅蛋白沉淀较完全，而且与主药及内标不发生反应，稀释体积也小(1∶1，V/V)。沉淀离心蛋白后直接取上清液进样分析，此法操作简便、快速，为EXH-1626浓度的测定提供了简便、可靠的方法。

4.3 EXH-1626在大鼠体内的药代动力学特征 大鼠口服给予250 mg/kg EXH-1626后，药时曲线呈现多峰现象，并且消除缓慢，明显不遵循一级动力学规律，t1/2也随给药剂量增加而延长，血药浓度和AUC与给药剂量明显不成正比，呈现非线性动力学过程，其在大鼠体内处置过程存在饱和效应。尾静脉注射10和20 mg/kg 2个剂量后，用AUC0-∞分别除以相应的剂量，所得比值分别为526.10和764.48，所得比值明显不同，t1/2随着剂量的增加而延长，CL也明显地随剂量大小而改变。因此，EXH-1626在大鼠体内具有非线性药代动力学特征。在80 mg/kg口服试验组中，每个动物药时曲线均出现双峰现象，尤其给予250 mg/kg剂量后，在时间靠后的取血点血药浓度出现反复升高，这给药动学参数的计算带来很大困难。近年来已发现相当多的药物单次给药后，血药浓度时间曲线出现双峰现象[3-6]，引起双峰或多峰现象的常见原因可能有：肝肠循环[3,7]、多部位吸收[4]、胃肠循环[8]和蛋白竞争等等，其中肝肠循环是该研究中产生多峰现象最可能的原因，这还有待进一步研究。

总之，本实验采用LC-MS法测定大鼠血浆中EXH-1626的浓度，该方法快速、准确、灵敏度高，适用于EXH-1626血药浓度的测定及其非临床药代动力学研究，为其新药研发奠定了基础。

参考文献：

[1] 王天麟,向华,徐晓莉,等.新型6-芳基茚并异喹啉酮衍生物的合成及抗肿瘤活性研究[J].中国药物化学杂志,2012,22(4):268.

[2] 李泰平,肖红,向华,等.RP-HPLC法测定EXH-1626的浓度[J].中国药师,2011,14(4):5-6.

[3] 程娟,李俊,宋珏,等.A771726在大鼠体内肝肠循环的研究[J].安徽医科大学学报,2010,45(3):338-341.

[4] 王莉.知母皂苷B-Ⅱ在大鼠体内药代动力学研究[D].合肥:安徽医科大学基础医学院,2010:70-72.

[5] 王筱婧.SHR116958的非临床药代动力学研究[D].上海:第二军医大学药学院,2010:83-85.

[6] 李秋莎,王长远,韩国柱,等.应用LC-MS/MS法研究茶多酚在大鼠体内的多组分药动学[J].中国新药杂志,2011,20(9):817-823.

[7] 孟素蕊,何景华,庞雁,等.紫杉醇注射液在小鼠体内的药代动力学及组织分布[J].药物分析杂志,2011,31(6):1073-1077.

[8] 谢寒.蝙蝠葛酚性碱人体药代动力学及中枢神经药理学研究[D].沈阳:辽宁中医药大学,2010:35-36.