参芪扶正注射液对肝癌细胞株H22的抑制作用及机制研究

薛 瑞，曹军华，李瑞生，李 灿

0 引言

肿瘤是目前危害人类健康和导致死亡的主要疾病。化疗是肿瘤三大常规治疗手段之一，但化疗药物作用缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体也带来损伤，特别是对免疫功能有很大的影响。参芪扶正注射液是国内首创的纯中药静脉型大输液，其主要成分为党参、黄芪，具有益气扶正的功效，为常用的抗肿瘤辅助药，可减轻化疗药的毒副作用[1]。本研究观察参芪扶正注射液体外对H22细胞增殖的抑制作用，体内对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响及对血清IFN-γ、TNF-α含量的影响，探讨其抗肿瘤作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物、材料与仪器 H22肝癌细胞由华中科技大学同济医学院提供；ICR小鼠，(20±2)g，雌雄兼用，由襄阳医学院动物实验中心提供，合格证号：襄医动字第2001001号；参芪扶正注射液(丽珠集团利民制药厂)；顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培养粉(Gibco公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶联免疫检测仪(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；干扰素-γ酶联免疫试剂盒(北京艾然生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子-α定量酶联检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 MTT法测细胞抑制率 H22细胞置于5%CO2、37℃培养箱中，用含100 mL/L小牛血清DMEM培养液培养，每24 h更换1次培养液，隔天传代1次，取传代后2 d处于对数生长期的细胞以1×105/mL密度接种于96孔培养板中，培养24 h后，分别加入顺铂(终浓度分别为10、20、40 μg/mL)，参芪扶正注射液(终浓度分别为5、10、20、40、80、160 μg/mL)，每组6个复孔，另设正常对照组。分别于48、72、96 h 3个时相各取一块96孔板进行MTT比色实验：每次于实验结束前加入MTT，继续培养4 h后，按常规采用酶标仪(波长570 nm)测各孔吸光度值(A)。按公式“(1-药物孔A值/对照孔A值) ×100%”计算细胞抑制率，以剂量和生长抑制率作直线相关分析。

1.3 模型小鼠的建立、分组及给药 ICR小鼠，除正常对照组外，每鼠接种0.2 mL H22细胞悬液于右腋窝皮下。24 h后，随机分为荷瘤对照组、阳性对照组及参芪扶正3个剂量组，每组10只。正常对照和荷瘤对照组灌胃生理盐水0.2 mL/d；阳性对照组腹腔注射5-Fu 25 mg/(kg·d);参芪扶正3个给药组分别按照25、50、100 mg/(kg·d)灌胃给药，皆给药10 d。

1.4 抑瘤率的检测 取血后，颈椎脱臼处死小鼠，立即完整剥离瘤块，称量瘤块重量，计算各组平均瘤块重量及抑瘤率，抑瘤率(%) =[1-(给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)]×100%。

1.5 血清IFN-γ含量的检测 停药次日摘除眼球法取血，常规分离血清，按照小鼠酶联免疫(ELISA)IFN-γ试剂盒使用说明操作，测定小鼠血清中IFN-γ的含量。

1.6 血清TNF-α含量的检测 停药次日小鼠摘眼球取血，分离血清，采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清TNF-α含量，参考说明书步骤操作，于492 nm处检测吸光度值(A492 nm)，根据浓度标准曲线计算TNF-α含量。

2 结果

2.1 对H22细胞生长的抑制作用 显微镜下观察，参芪扶正注射液作用后的H22细胞排列稀疏，随作用时间延长和药物浓度的增加细胞密度逐渐减少。MTT实验结果显示，各剂量组参芪扶正均可抑制H22细胞的增殖，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制率增加，参芪扶正对H22细胞的抑制作用具有统计学意义。结果见图1。

图1 参芪扶正对H22细胞增殖的抑制作用

2.2 对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 实验结果显示，5-Fu和参芪扶正三个剂量组瘤块重量均明显低于荷瘤对照组(P<0.01，P<0.001)，参芪扶正高、中、低三个剂量的抑瘤率分别为47.43%、32.43%和21.42%，呈现剂量依赖性，提示参芪扶正注射液对H22荷瘤小鼠肿瘤的生长具有明显的抑制作用，结果见表1。

表1 参芪扶正注射液对荷H22小鼠的抑制作用

注：与阴性对照组比较，*P<0.01；**P<0.001

2.3 对荷瘤小鼠血清IFN-γ含量的影响 H22荷瘤小鼠IFN-γ含量明显受到抑制，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)；5-Fu抑制荷瘤小鼠血清IFN-γ的形成，与荷瘤对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；参芪扶正三个剂量组均可提高荷瘤小鼠血清IFN-γ含量，与荷瘤对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表2。

2.4 对荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影响 荷瘤对照组小鼠的TNF-α含量明显低于空白对照组(P<0.01)；5-Fu能够提高荷瘤小鼠的TNF-α含量，与荷瘤对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；参芪扶正中、高剂量可提高荷瘤小鼠的血清TNF-α含量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 参芪扶正注射液对荷瘤小鼠IFN-γ的影响

注：与空白对照组比较，△P<0.01；与荷瘤对照组比较，*P<0.05；**P<0.01

表3 参芪扶正对荷瘤小鼠血清TNF-α 含量的影响

注：与空白对照组比较，△P<0.01；与荷瘤对照组比较，*P<0.05

3 讨论

体质内虚是肿瘤发生的主要病因，正气亏损，正邪斗争始终存在于肿瘤的发生、发展过程中[2]。肿瘤因正气虚而得病，因虚而致实，故在恶性肿瘤治疗方面，祛邪虽不可轻视，但益气扶正占有更加举足轻重的地位。中药制剂参芪扶正注射液是采用黄芪、党参等中药为主要原料，根据传统中医理论，运用现代制药工艺研制而成，具有扶正固本、益气补虚、活血化瘀的功效[3-6]。从中医理论上参芪扶正注射液应具有良好的抗肿瘤作用。MTT实验结果显示，参芪扶正注射液体外可抑制H22细胞的增殖，且抑制率具有浓度和时间依赖性；体内实验观察到参芪扶正注射液可明显抑制荷H22小鼠肿瘤的生长。

IFN-γ是一种糖蛋白，具有较强的免疫调节功能，能增强细胞功能，加快免疫复合物清除和提高吞噬异物功能，对淋巴细胞具有双向调节作用[7-8]。TNF-α主要由单核-巨噬细胞产生，可以直接杀伤肿瘤细胞，也可通过抑制肿瘤血管生成等间接途径杀伤肿瘤细胞，还可诱导许多不同来源肿瘤细胞凋亡[9]，是迄今为止所发现的抗肿瘤作用最强的生物活性因子之一。现在，IFN-γ和TNF-α在肿瘤的免疫调控监视及肿瘤发生与发展中的作用越来越受到重视[10]。

本研究结果显示，荷瘤对照组小鼠血清IFN-γ和TNF-α含量都明显受到抑制，说明小鼠荷瘤以后其免疫功能受到抑制。参芪扶正注射液3个给药组皆可显著促进荷瘤小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的表达，这为参芪扶正注射液通过增强荷瘤机体免疫功能而发挥抗肿瘤作用提供了免疫分子学依据。参芪扶正注射液抗肿瘤作用还有其他机制，有待进一步研究。

参考文献：

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