苦参碱对人前列腺癌PC-3M细胞周期与凋亡的影响

王桂秋

0 引言

前列腺癌是一种男性前列腺组织中的恶性肿瘤，其发病是前列腺腺泡细胞基因突变导致增殖不受控制的结果[1]。随着病情的恶化，前列腺癌还会扩散到邻近器官，甚至转移到远端部位，尤其是淋巴结和骨髓[2]。临床上，该病的治疗包括手术疗法、化学疗法、放射疗法、激素疗法单一治疗或是几种疗法联合应用[3]。而中药治疗癌症具有其独特的好处，包括低毒、多靶点、药性温和等[4]。苦参碱提取自豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait)的根，具有利尿、抗病原体、抗肝炎、抗炎等作用，以及提高免疫力的药理活性[5-6]。因此，在当前的实验中，我们建立体外稳定的前列腺癌PC-3M细胞模型，以细胞凋亡为研究目标，进一步探讨苦参碱的抗肿瘤作用与凋亡相关通路的内在联系，为证明其对PC-3M促凋亡的作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人前列腺癌PC-3M细胞，购自上海肿瘤研究所。

1.1.2 药物与试剂 苦参碱(纯度>98%)：Spectrum公司。DMEM培养基：Invitrogen公司。小牛血清：Amersco公司。胰蛋白酶：Amersco公司。0.25%胰酶：Gibco公司。甲基偶氮唑盐(MTT)：Sigma公司。二甲基亚砜(DMSO)：南京建成生物工程研究所。PI染色试剂盒：Roche公司。Cyclin D1蛋白抗体：南京建成生物工程研究所。DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。p-ERK1/2抗体：Invitrogen公司。蛋白裂解液：南京建成生物工程研究所。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：Invitrogen公司。

1.1.3 仪器 Model 311 CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)。IX71-A21PH倒置显微镜(日本Olympus公司)。SZX型超净工作台(上海浦东跃欣科学仪器厂)。GelDoc XR+凝胶成像系统(美国Bio-rad公司)。JC303A-T电热恒温培养箱(成都一恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 无菌环境下，培养基RPMI-1640中加入新配置15% FBS、200 μg/mL青霉素、l50 μg/mL链霉素(4 ℃保存)。PC-3M细胞复苏后，接种在培养瓶安置CO2培养箱中孵化(37 ℃，5% CO2)。D-Hank′s液冲洗3次，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶液，置37 ℃约10 min。终止消化后，细胞悬液移入无菌刻度离心管中，低速离心10 min后消化3次，进行细胞计数步骤。

1.2.2 分组及给药 精密称取苦参碱100 μg，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基稀释成不同浓度的MR终浓度(0、30、60、120 μM)，每孔100 μL，同时设5个平行孔/组，重复实验5次，获取平均值数据。应用Graphpad Prism软件计算IC50(半数抑制率)，即MR治疗PC-3M细胞24、48、72 h后的IC50值。同时增设对照组。细胞增殖抑制率=(OD对照-OD治疗)/(OD对照-OD空白)×100%

1.3 指标检测 MTT法检测MR对PC-3M抑制率，PI染色检测细胞形态学的变化，免疫组织化学法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达，Western blot法检测细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化蛋白水平。

2 结果

2.1 MR给药后对PC-3M细胞抑制作用 MTT法结果显示，不同浓度MR抑制PC-3M的作用逐渐增强，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。此外，随着时间的增加，MR的抑制作用不断增强，提示MR治疗有一定的时间-剂量依赖性。见图1。

图1 MR给药对PC-3M细胞增殖的抑制作用

2.2 MR给药后对PC-3M细胞组织形态学变化的作用 PI染色结果表明，空白组中PC-3M的细胞形态规则，轮廓清晰，核仁透亮，核浆比例正常。30 μM浓度MR给药72 h后，PC-3M细胞体积缩小，细胞质空泡增多，核收聚，出现细胞凋亡。而经过60、120 μM浓度MR给药，PC-3M细胞皱缩、脱落、密度降低，同时凋亡细胞计数增多。见图2。

图2 MR给药后对PC-3M细胞形态的影响(PI染色，×100)

2.3 MR给药后对PC-3M细胞Cyclin D1表达的影响 免疫组化结果显示，空白组中PC-3M细胞Cyclin D1阳性细胞数量较多，处于激活状态。经MR给药后，PC-3M细胞Cyclin D1阳性细胞表达明显减少，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。此外，结果显示一定的时间-剂量依赖关系。见图3。

图3 MR给药抑制PC-3M细胞Cyclin D1的表达(免疫组织化学染色，×100)

2.4 MR给药后对PC-3M细胞Cyclin D1表达的影响 Western blotting结果显示，空白组内源性p-ERK1/2水平上调，处于过表达状态。经MR给药后，PC-3M细胞增加的p-ERK1/2表达有效地下调，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。同时，实验结果提示一定的时间-剂量依赖性。见图4。

3 讨论

前列腺癌是严重危害男性生命的恶性癌症之一，当前主要采用放疗、化疗、手术、药物治疗等措施进行防治，但都普遍存在预后差和复发性[7]。而传统中药在前列腺癌的防治工作方面获得了有效的进步[8]。在本实验中，MTT结果表明，在生理状态下PC-3M细胞增殖速度快，提示调控肿瘤细胞的过度增殖可以作为治疗的方向。MR给药后，能显著抑制PC-3M增殖与分化，提示MR具有抑制肿瘤细胞增殖作用。此外，PI染色结果也说明，MR给药能诱导PC-3M细胞发生形态变化，发生细胞凋亡现象。

图4 MR给药抑制PC-3M细胞p-ERK1/2的活性

Cyclin D1是细胞周期调节因子之一，不受控制的表达是原发性前列腺癌的特征，对临床预后诊断具有重要意义[9]。肿瘤细胞中，Cyclin D1加速癌细胞周期素过度表达，同时造成CKIs细胞分裂的蛋白失活，从而加速肿瘤细胞的增殖、分化和生长[10]。免疫组化结果显示，PC-3M细胞内源性Cyclin D1过度表达，说明Cyclin D1的异常表达促进了PC-3M细胞不断增殖和分化。MR给药后，能有效抑制PC-3M细胞Cyclin D1的表达，提示MR通过抑制PC-3M细胞Cyclin D1的活性而发挥抗肿瘤作用，结果与MTT实验数据一致。

研究发现，细胞外调节蛋白激酶ERK1/2的生物学效应与细胞的增殖和分化密切相关，作用机制与其通过磷酸化反应可调节某些转录因子的活性，从而引起靶蛋白的活性变化，最终调节细胞代谢功能[11]。此外，ERK1/2的抗凋亡作用与激活磷酸化抗凋亡分子(如bac-2，Bad等)以及激活转录因子(如Cyclin D1等)有关[12]。因此，药物干预作用在肿瘤细胞的ERKl/2靶点有助于抑制其发生发展。本实验研究表明，PC-3M细胞内源性p-ERKl/2明显上调。经MR给药后，PC-3M细胞p-ERKl/2的表达被有效地下调，提示MR作用与PC-3M细胞ERKl/2靶点，抑制其生理活性，进而调节蛋白组件Cyclin D1的表达，进而诱导癌细胞发生细胞凋亡，故推测MR抗肿瘤作用与其抑制癌细胞内源性ERK1/2/Cyclin D1通路有关。

参考文献：

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[4] 何坚,胡建新,孙兆林,等.参芪结合雄激素阻断治疗前列腺癌[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(1):189.

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[10]Jirawatnotai S,Hu Y,Michowski W,et al.A function for cyclin D1 in DNA repair uncovered by protein interactome analyses in human cancers[J].Nature,2011,474(7350):230.

[11]Roskoski R Jr.ERK1/2 MAP kinases:structure,function,and regulation[J].Pharmacol Res,2012,66(2):105.

[12]Li DY,Tao L,Liu H,et al.Role of ERK1/2 in the anti-apoptotic and cardioprotective effects of nitric oxide after myocardial ischemia and reperfusion[J].Apoptosis,2006,11(6):923.