犬椎间盘脱出模型的建立及其脊髓微循环与组织学变化观察

王雪乔，饶宇腾，吴伟澎，程 鹏，李 伟，姜代勋，陈 武

(1.北京农学院(中医药)北京市重点实验室；2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

椎间盘脱出症是人类医学和兽医临床上犬的多发病和疑难病。通过外科手术减压疗法解除脊髓压迫，是常用治疗方法之一，但在犬对深部痛觉丧失超过48 h的重症病例无效。然而以电针为主的针灸疗法，在无创的情况下对犬的椎间盘脱出症显示疗效同样显著[1]，其机理可能与改善脊髓微循环和组织微观结构有关，需要进一步研究。由于对临床病例的脊髓状态评价困难，且已有的犬椎间盘脱出模型多为短时间(0.5～1) h压迫[2-4]，不能很好地模拟和评价重症椎间盘脱出症的过程。本研究尝试建立犬的椎间盘长时间脱出模型，并采用激光散斑多普勒血流测定法(Laser-Doppler flowmetry, LDF)监测压迫后脊髓血流量(spinal cord blood flow, SCBF )和组织学变化，为进一步揭示犬椎间盘脱出症的病理与治疗机理积累资料。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

健康成年杂种犬9只，体重(5～10) kg (7.97±1.03)，动物生产合格证号[SCXK(京)2011-0006]，饲养于北京农学院实验动物房[SYXK(京)2010-0003]。实验犬随机分为正常对照组(n=3)，模型组(n=6)。正常对照组不进行手术，常规饲喂。

1.2 主要仪器和试剂耗材

激光多普勒散斑血流检测视频系统(PeriCam PSI System, Perimed, Sweden)，呼吸麻醉机(SurgiVet,美国)，超声骨刀(速迈医疗)，高频电刀(北京中科科仪技术发展有限责任公司)，碘海醇(50 mL：15 g，扬子江药业集团有限公司)，异氟烷(100 mL，鲁南贝特制药有限公司)，注射用氨苄西林(悦康药业集团北京凯悦制药有限公司)，6Fr一次性无菌双腔导尿管(大连库利艾特医疗制品有限公司)，焦油紫(Sigma-Aldrich)，苏木精(Amresco Company)，伊红(Amresco Company)。

1.3 犬椎间盘脱出模型的建立

麻醉前15 min阿托品(0.02 mg/kg)皮下给药，静脉推注丙泊酚(6 mg/Kg)诱导麻醉，气管插管异氟烷吸入维持麻醉。

动物俯卧保定，以第一腰椎(L1)为中心消毒。手术严格无菌操作，第13胸椎至第2腰椎(T13-L2)棘突左侧旁开约1.5 cm切开皮肤，沿皮肤切口切开皮下脂肪，显露并切开浅深层外筋膜，钝性分离髂腰肋肌纤维，骨膜剥离器钝性剥离背最长肌、多裂肌，切断附着肌腱，牵引器紧贴肋头前缘放置在创口前后，高频电刀切断乳头突周围附着肌肉，用咬骨钳去除乳头突，超声骨刀打磨L1-L2段锥板，锥板咬骨钳暴露左腹侧L1-L2段脊髓。将6Fr双腔导尿管沿硬膜向前伸至T12-T13，向内缓慢注入约0.5 mL碘海醇(图1)，封堵固定导尿管，脊髓血流监测完毕后分层缝合切口。术后肌注抗生素(氨苄西林，25 mg/kg，每天3次)，第2天正常饲喂，对食欲不振者行常规输液支持疗法。

术后进行X线检查，确认气囊压迫存在(图2)，并进行运动机能评分，判断造模是否成功。

压迫48 h后气囊减压，抽出导管解除压迫。

图1 球囊压迫法，沿硬膜插入后注入碘海醇。

图2 犬椎间盘脱出模型压迫后X线片。

1.4 SCBF微循环测定

术中暴露L1-L2段脊髓后，LDF散斑血流检测仪监测血流5 min，导尿管压迫后监测血流5 min，14 d后再次开创暴露脊髓，监测相同脊髓段血流10 min。(仪器相关参数设定: 监测激光与L1-L2段脊髓垂直，探头与L1-L2段脊髓左侧的监测距离设定约为16 cm，分辨率为0.15mm，监测区域图像面积约10～15 mm2，圆心位于L1段脊髓左侧的中心，采样频率: 10图像/s)

1.5 运动功能评分

同一执业临床兽医师于术前、1 d、4 d、7 d、14 d采用犬TSCIS评分法[6-7]，从步态、本体感受器定位、痛觉感受方面对各组犬的运动功能进行评价(正常为10分)。 步态：最小离地间隙是指在犬肢体伸展时将四肢抬离地面的能力；本体感受器定位：本体感受的测定方法：给予外力支撑犬的体重，轻轻地将其爪背面着地，恢复正常位置的时间超过2 s则判为反应迟钝。伤害感受：深部伤害感受的测定方法：止血钳横行钳闭远端肢体或者甲床。浅部伤害感受的测定方法：止血钳钳夹趾间蹼。

1.6 脊髓组织病理学观察

14 d后采集损伤段脊髓，HE和焦油紫染色观察脊髓组织学变化并进行神经元计数。观察脊髓白质和灰质神经元形态及神经元数量变化，脊髓中央管水平线以下设为计数面积，神经元采用人工双盲计数法[8]，P<0.05表示组间差异显著，P<0.01表示组间差异极显著。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 犬椎间盘脱出模型的运动功能评分结果

图3 犬压迫前后运动功能评分结果(P<0.01)

图3可见，术前TSCIS评分结果皆为满分10分。术后第1天左、右后肢的评分结果分别为(0.33±0.23)、(0.67±0.37)，两后肢均丧失深部痛觉。与压迫前相比，后肢运动机能评分下降极显著(P<0.01)，至术后14 d左后肢(3±0.37)、右后肢(4±0.71)运动机能评分有所升高，但与术前相比仍旧极显著下降(P<0.01)，模型建立成功。正常对照组1 d及14 d左右后肢运动功能评分均为满分10分。

2.2 犬椎间盘脱出模型脊髓血流量变化

图4 犬椎间盘脱出模型压迫前后脊髓血流量变化(P<0.05)

犬椎间盘脱出模型压迫后5 min(94.08±12.52)和14 d后(97.36±10.39)脊髓血流量显著低于(P<0.05)压迫前(131.02±5.67)(图4)。

2.3 犬椎间盘脱出模型脊髓组织形态学观察

正常对照组脊髓白质纤维束排列紧密有序，左侧腹角灰质可见深蓝色大而圆的神经元且数量较多，多突起，胞浆内尼氏小体结构完整，细胞核位于中央；模型组脊髓白质纤维束断裂，成空泡状，灰质可见神经细胞崩裂，尼氏小体不明显，神经元数量减少，出现固缩。脊髓腹角(脊髓中央管水平线以下)正常神经元计数模型组为(13.58±3.14)个，极显著低于(P<0.01)正常对照组(34.52±4.68)个(图5,6见彩插1)。

3 讨论

椎间盘脱出症是由于椎间盘的纤维环变性破裂，中央髓核脱出压迫脊髓及其相应脊神经根，导致神经通路被阻断，同时压迫造成脊髓血液循环障碍，加速神经细胞死亡，引起运动机能障碍[9]。临床实践中，动物短时间内出现的重度瘫痪往往伴随后肢深部痛觉完全丧失甚至尿闭或尿失禁，这多由于髓核瞬时压迫引起脊髓急性损伤，随着压迫持续存在进而引起脊髓局部缺血缺氧造成继发性损伤[9]。球囊压迫法能够较好地模拟椎间盘脱出引起的急性重度持续性压迫，并可对压迫程度进行适度的调节，且重复性良好。早期球囊压迫法是通过椎板全切术暴露脊髓进行压迫，但对脊髓周围组织的损伤较大。经过改良，现多采用经皮穿刺至蛛网膜下腔后压迫[10-13]，但此法也有其局限性，主要是压迫位置很难准确定位在脊髓正下方或侧下方，因而无法模拟椎间盘髓核脱出对脊髓的压迫。此外，由于没有暴露脊髓，所以无法直接监测脊髓微循环血流量的变化。本研究采用的半椎板切除术是解除髓核压迫的临床常用手术通路，其既减少对脊髓周围组织的损伤又客观评价脊髓状态，更接近犬椎间盘脱出症的自然损伤过程，符合理想椎间盘脱出模型的要求。球囊内注入碘海醇代替生理盐水，有利于术中定位及术后评价。研究结果模型组后肢运动机能极显著下降，出现后肢瘫痪，失去深部痛觉，与临床上犬的椎间盘脱出症一致。

微循环障碍是机体原发性和继发性致病的重要因素，也与细胞再生和机能恢复密切相关，因此对其进行测定能客观评价脊髓损伤和机能恢复的程度。激光散斑血流监测仪是一种监测组织血流的常用方法，其通过光电探测器接受反射光，然后转化成电信号，生成组织血细胞移动的数据。Yasminda Malik等[14]指出LDF受多种因素影响，例如室温、体位、外部光源等因素。为此，本实验在监测过程中保持室温在25℃，关闭无影灯，加热毯温度保持在38℃，输液暂停，同时人员保持安静，减少走动，尽最大可能减少干扰因素，以获取可信的数据。

课题组前期研究表明椎间盘脱出大鼠模型SCBF下降显著，且压迫后即刻下降，前后分界明显[5]。本试验观察到椎间盘脱出模型犬SCBF同样下降显著，但压迫后瞬时脊髓血流量呈缓慢下降至稳定值，这可能与压迫物选择不同和种属间差异有关。压迫后脊髓血流量显著下降，且14 d后脊髓血流量仍保持较低水平，这说明急性和慢性的脊髓血流微循环障碍可能是椎间盘脱出症致病的重要机制。

造模后14 d在观察到脊髓微循环血流量显著降低的同时，模型组出现神经元变性坏死、尼氏小体固缩、白质空泡化等形态学变化。已有研究表明脊髓灰质神经元的迁移受血管密度和分布影响[15]，说明脊髓微循环障碍对神经元修复的影响。提示调节脊髓微循环，改善脊髓神经细胞微环境，促进脊髓神经细胞再生和重构可能是治疗该病的关键。14 d后脊髓造影显示压迫部位造影剂仍无法正常通过，说明压迫并未随着解压而消失，这可能正是发病48 h后手术减压效果不佳的原因。

上述结果表明，此球囊压迫法建立的重度椎间盘脱出模型能够再现临床经过，可以作用于观察脊髓微循环和组织形态学变化，用于该病病理和治疗机理的相关研究。

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