利用超数排卵技术进行优化C57BL/6J小鼠的生物净化体系

冯 颖，王芊芊，陆文昊，曹敏梁

(1. 浙江大学实验动物中心， 杭州，浙江 310058；2. 台州医院生殖中心，台州，浙江 317000)

C57BL/6J近交系小鼠以其特有的生理学特性，被广泛用于制作转基因小鼠。在转基因小鼠制备、饲养及品系共享等过程中，容易造成病原微生物的感染。这些病原体不仅对实验结果产生干扰，对人类的健康也产生极大的威胁。因此，拥有标准化的SPF级实验小鼠是相关研究的基础，而感染小鼠通过生物净化方法达到SPF级标准是目前唯一有效的技术手段，生物净化方法主要包括剖宫取胎和胚胎移植。剖宫取胎操作相对简单，但存在净化不彻底和难以计算最佳剖宫时间等弊端；而胚胎移植则需要掌握扎实的胚胎移植技术。本实验以C57BL/6J野生型雌鼠为实验对象，对其注射不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促进腺激素(hCG) 进行超数排卵后，与剖宫取胎和胚胎移植两种方法相结合，通过比较分析平均卵母细胞数、平均胚胎数、受精率、见栓率、胚胎移植成活率，为生物净化提供优化方案。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验环境

4周龄SPF级C57BL/6J雌鼠108只，18～22 g，均来源于上海斯莱克实验动物有限公司 [SCXK(沪)2007-0005]，按照SFP级标准饲养于浙大实验动物中心屏障系统，自由饮水，室温(20±2)℃，光照12 h/d，(8∶00～20∶00)，经过1周的适应性饲养。

1.2 仪器与试剂

超净工作台，CO2恒温培养箱( Thermo )，体式解剖镜(Olympus SZ61 )，养皿 ( 35 mm，60 mm，Corning )，酒精灯，相差显微镜(Nikon SM2645)，镊子，口吸式移卵管；注射用血促性素(PMSG)、注射用绒促性素(HCG)购自宁波市三生药业有限公司，其余试剂均为Sigma公司产品。

1.3 动物实验

1.3.1 试验分组：5周龄的C57BL/6J雌鼠108只，根据剖宫取胎、体外和体内胚胎移植三种方法分为三个试验，每个试验四个剂量组，每组各12只，重复3次。

1.3.2 小鼠超排：下午4点，四组分别腹腔注射5 IU、7.5 IU、10 IU、15 IU的PMSG，48 h后分别注射相同剂量的HCG。试验一：四组雌鼠注射HCG后，与同系性成熟雄鼠合笼，次日验阴栓并记录，18 d后进行剖宫取胎进行统计；试验二：四组雌鼠注射HCG 15 h后，收集卵母细胞，进行体外受精及2-细胞胚胎移植；试验三：四组雌鼠注射HCG后，与同系性成熟雄鼠合笼，次日验阴栓并记录，1.5 d后获取体内2-细胞胚胎并进行移植。

1.3.3 培养基准备：采卵前1 d，用直径35 mm 培养皿做HTF培养滴，石蜡油覆盖，放入37℃，含5% CO2培养箱中培养12 h。

1.3.4 精子采集：取交配过的性成熟C57BL /6J雄鼠1只，颈椎脱臼处死，剪下附睾的上体部，用注射针刺破，挤出精子团放入HTF培养滴中，CO2培养箱中放置1 h 再行体外受精。

1.3.5 卵母细胞的收集：用颈椎脱臼法处死小鼠，剖宫取出输卵管放入盛有M2培养液的表面皿中，显微镜下放入矿物油中，找到输卵管膨大部，用解剖针稍刺破膨大部，将卵母细胞团引出，并导入到HTF培养基液滴中。

1.3.6 体外授精(IVF)：将培养1h 的精子悬浮液镜下检查精子活力和精子数量，用移液器吸取精液10 μL( 约含精子200个/μL) 放入培养滴中，加入卵母细胞 (50～100) 个，培养皿放CO2培养箱中培养6 h后，用预热过的HTF培养滴清洗受精卵两次，再放回CO2箱中过夜培养。

1.3.7 早期胚胎的形态学评价：培养24 h后的受精卵做镜检，统计2-细胞胚胎，未受精卵及异常卵。其中，2-细胞胚胎和未受精卵形态正常，具有完整的透明带，不含空泡和碎片，胞质明亮均一，属于质量好的卵；由于精子的活力，受精能力等原因，造成了一部分卵未受精，颜色发暗并带有胞质颗粒的卵判定为死亡卵；胞质内含有碎片、部分胞质溶解判定为畸形卵；死亡卵和畸形卵都属于异常卵。挑出正常发育的2-细胞胚胎，移植备用。

1.3.8 体内2-细胞胚胎收集：在供体鼠见栓1.5 d后，将其颈椎脱处死，剪下双侧输卵管，在超静工作台中用口吸管吸取约0.2 mL的M2培养液，一端插入输卵管的伞口，将胚胎冲出。在镜下收集形态正常且透明带完整的2-细胞期胚胎，放入新鲜的M2 培养滴中，移植待用。

1.3.9 假孕小鼠的准备：将SPF级ICR雌鼠与ICR结扎雄鼠 1:1合笼，第二日验栓，有阴栓的作为受体鼠。所有实验均在浙江大学实验动物中心屏障系统内完成。

1.3.10 2-细胞胚胎移植：用口吸管吸25枚胚胎，末端再吸一个指示性的小气泡。受体小鼠用戊巴比妥麻醉，剃掉小鼠背左侧小面积被毛，75%酒精消毒，透过皮肤看到脂肪垫的位置剪一个纵向切口，拉出脂肪垫，牵引出卵巢、输卵管和子宫。用脂肪夹夹住脂肪垫，固定好卵巢和输卵管。解剖镜下，在输卵管的喇叭口与壶腹部之间用维纳斯剪刀剪一小口，再将移卵针朝壶腹部方向插入输卵管中，将所有胚胎吹入左侧输卵管。以输卵管中可见指示小气泡作为胚胎全部吹入的标志。将脂肪垫、卵巢、输卵管一起放回腹腔中，缝合肌肉和皮肤。多余胚胎进行冷冻保存。

2 结果

2.1 剖宫取胎实验结果

四组剂量超排后，通过剖宫取胎实验结果见表1。从表中可知，5IU剂量组见栓率最高，见栓率和平均产仔数均差异不显著(P>0.05)。

2.2 体外胚胎的获得及其胚胎移植结果

四组剂量超排后，体外胚胎的获得以及移植结果见表2。从表2可知，4组剂量超排后平均卵母细胞数、异常卵率差异显著(P<0.05)。其中，注射10 IU实验组平均卵母细胞数为(30.33±0.89)枚，显著高于其它3组，5 IU组的(23.44±0.51)枚、7.5IU组的(23.33±0.67)枚，显著高于15 IU组的(17.33±0.34)枚；5 IU组剂量的异形卵率最低，为(3.79%±0.81%)，与7.5 IU剂量组(5.24%±0.84%)差异不显著，与10 IU、15 IU组均差异显著，15 IU组剂量的异形卵率最高，为(8.37%±0.92%)，与其它3组均差异显著。四个剂量组的体外受精率差异不显著(P>0.05)；体外受精平均2-细胞胚胎数显著差异(P<0.05)，10 IU组最高为18.78±0.39枚，与其它三组均差异显著，5 IU组和7.5 IU组差异不显著，15 IU组最低，为13.00士0.33枚，均显著低于其它三组；同时，将四组剂量超排后获得的卵母细胞进行体外受精，将获得的2-细胞胚胎进行移植，产仔率均差异不显著(P>0.05)。

2.3 体内2-细胞胚胎的获得及其胚胎移植结果

四组剂量超排后，体内2-细胞胚胎的获得及其胚胎移植结果见表3。从表中看出，平均胚胎数差异显著(P>0.05)，移植后产仔率差异不显著(P>0.05)。其中，10 IU组获得的平均胚胎数最多，为18.00±0.50枚，与其它3组均存在显著差异；其次是5 IU组，也显著高于其它两组，而7.5 IU组和15 IU组之间差异不显著。

表1 四组剂量超数排卵后剖宫取胎的结果

表2 四组剂量超数排卵后体外胚胎的获得及其移植的结果

表3 四组剂量超数排卵后体内胚胎的获得及其移植的结果

3 讨论

随着C57BL /6J转基因小鼠动物模型的广泛应用，其生物净化工作也日渐频繁。传统的剖宫取胎法容易导致垂直传播的病毒净化失败，但由于操作比较简单，在不具备胚胎移植技术的条件下也是一种选择。本文尝试通过超排的方法达到人工控制发情。通过比较，虽然小鼠的见栓率和平均产仔数没有显著差异，但注射5 IU剂量组的小鼠交配后见栓率最高，该剂量适用于C57BL/6J背景鼠进行剖宫取胎生物净化，提高其受孕率。因为高剂量的激素对小鼠的内分泌会造成一定的紊乱，导致交配的失败。因此，只要激素能激发小鼠发情，使它交配成功，激素量越少越好。实验中发现，超排后合笼的小鼠有一部分见栓却没怀孕，有研究者发现大鼠相似的现象[1]。这主要是由于超排后，雌性动物体内会出现高水平的雌二醇-17β，从而刺激输卵管的运动性，加速了胚胎的迁移，导致胚胎过早暴露于不适合其发育的内环境，造成胚胎大量丢失[2]，不利于受精卵的发育和妊娠[3]。

相对剖宫取胎，采用胚胎移植法手术时间可控性强，可最大限度避免病毒经胎盘感染仔鼠，仔鼠成活率高[4]，但它需要大量的胚胎，而胚胎的获得分体内和体外胚胎。如果有较多生殖状态好的转基因雄鼠，可超排野生型雌鼠与转基因雄鼠交配，获得体内2-细胞胚胎进行移植。本次试验中，注射10 IU组获得的体内胚胎数最多，为最佳剂量。但这种方法需要较多的转基因雄鼠，而且一次冲出的胚胎数量受限，一般建议采用IVF。当雄鼠不多或者状态不好的情况下，更能体现出体外受精的优势。只需一只雄鼠，超排大量野生型雌鼠，一次获得大量的卵进行IVF，获得大量的体外受精胚，基本能一次完成净化工作，节约成本，提高效率。本次注射10 IU剂量组能获得最多的卵母细胞，这与部分文献报道有所差异[5-7]，可能与所用激素、小鼠周龄不同以及品系间存在个体差异有关[8]。本文仅就注射不同剂量的激素对C57BL /6J小鼠进行超排，初步探讨超排在C57BL/6J小鼠生物净化体系中的应用，但是超数排卵是一系列极为复杂的生理过程，影响因素很多[9-10]，其对胚胎发育和质量的影响目前仍然说法不一[11-13]，有待今后进一步深入研究。

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