整合CAMVA和BCOP方法检测化妆品的眼刺激性

秦 瑶，程树军，黄健聪，黄 玲，陈 彧

(1. 广东出入境检验检疫技术中心,广州 510623; 2. 新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063)

欧盟化妆品动物实验禁令的发布和实施，为检测机构在产品安全性评价中建立科学合理的体外替代方法提出了要求。既然化妆品眼刺激评价的Draize兔眼试验已被法规禁止，那么在多种有效的体外方法中选择建立整合应用策略是比较理想的模式，这些方法包括离体鸡眼试验(ICE)、鸡胚绒毛膜尿囊膜试验(HET-CAM、CAMVA、CAMTB)、牛角膜浑浊及通透度试验(BCOP)、短时间暴露试验(STE)、荧光素漏出试验(FL)等[1-3]。本实验研究组合两种有效的眼刺激体外方法——鸡胚绒毛膜尿囊膜血管试验(CAMVA)和BCOP试验，对60种个人护理产品眼刺激性进行评价，并与动物实验进行比对，建立CAMVA-BCOP组合策略，为个人护理用品的眼刺激性的体外评价提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 样品

市售化妆品合计60种，分为3类，清洁沐浴类产品(沐浴露、洗发水、清洁液等)22种，眼部用产品(粉底、眼线、眼霜、睫毛膏、眉笔等)17种和护肤类产品(防晒霜、防皱霜、祛斑、植物精油等)21种。

1.2 主要材料、试剂及仪器

SPF级白莱杭鸡受精鸡胚(购于新兴大华农禽蛋有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(粤)2008-0019，牛眼球取自广州地区屠宰场，普通级实验兔购自广东省医学实验动物中心(实验动物生产许可证：SCXK(粤)2008-0002。含酚红及不含酚红MEN培养基(含1% FBS和L-谷氨酰胺)、HBSS、荧光素钠均购自Sigma公司，含Ca2+、Mg2+的DPBS，10%氢氧化钠(广州化学试剂厂)，“O”形特富龙环(孔径0.8 mm)，角膜浊度仪(德国BASF-OP3.0)，全波长酶标仪(美国Thermo)，培养箱(德国Memmert)等。

1.3 CAMVA方法及眼刺激性分类

将1 d龄鸡胚置于培养箱37℃孵育，于第4天在鸡胚窄端钻一小孔，抽取约3 mL蛋清后用火胶棉封住小孔。在鸡胚位置的上方开约5 mm×10 mm的矩形小窗并移除蛋壳，暴露鸡胚，以保鲜膜覆盖。随后放回培养箱继续孵育。第14天，取出鸡胚，扩大观察窗，于绒毛尿囊膜上放置“O”形特富龙环，取40 μL(固体40 mg)不同浓度受试物加入环内，37℃孵育。30 min后，观察血管变化，计数阳性反应(出现溶血、血管消失、血管凝固等)鸡胚个数，最后计算RC50，即引起一半鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。如果样品RC50>3%，判定为无刺激性，≤3%，则为有刺激性[4]。

1.4 BCOP方法及眼刺激性分类

参考OECD指南437，取新鲜牛眼球切取角膜，将其装配于专用支架中。前后室均填满无酚红MEM，于(32±1)℃培养箱平衡1 h后用浊度仪读数角膜浊度本底值。移除前室培养基后加入750 μL未稀释液体受试物(固体为20%悬液)，孵育10 min(固体为4 h)，用含酚红MEM冲洗至样品无残留。前室重新填满无酚红MEM后返回培养箱孵育2 h(固体无需后孵育)后读取终末浊度值。去除前室培养基，加入1 mL 0.4%(固体为0.5%)由含Ca2+、Mg2+DPBS配制的荧光素钠溶液，孵育90 min。收集后室全部液体，混匀后取360 μL在490 nm波长下读取吸光度值。根据公式计算体外刺激评分值(in vitro irritancy score, IVIS)：IVIS=浊度值 + 15 × 吸光度。每个样品重复3个角膜。IVIS≤3，预测无刺激性，3～55预测刺激性(包括2A和2B类)，>55预测严重刺激性[5]。

1.5 Draize兔眼试验

成年健康家兔，在其中一只眼睛结膜囊滴入0.1 mL受试物，另一只眼睛作为对照，于染毒后24 h、48 h、72 h、4 d、7 d观察眼睛结膜、角膜、虹膜反应。根据改良最大平均得分MMAS (modified maximum average score)进行分类：MMAS≤2.5为无刺激性， 2.5～25为轻刺激性，25～50为中度刺激性，>50为严重刺激性/腐蚀性。

1.6 统计学方法

比较不同方法结果对物质分类是否具有一致性，采用Kappa一致性检验 (Kappa≥0.75一致性好；0.75

2 结果

60种产品的体外测试和动物测试结果见表1。经Draize试验的样品，结果为42种无刺激性，11种微弱刺激性、5种中等刺激性和2种严重刺激性。CAMVA试验结果为41种无刺激性，19种为有刺激性；BCOP试验结果为35种无刺激性，21种轻-中刺激性，4种严重刺激性。

以体内实验为判断标准，参考替代方法验证的准则[2]。CAMVA方法可以区分41种无刺激性样品，特异性为97.6%(41/42)，可区分全部18种有刺激性的样品，敏感性为100%(18/18)，但对刺激程度的预测效果不理想，总的分类一致性达到98.3%(59/60)，Kappa=0.890。阳性预测性为94.7%(18/19)，阴性预测率为100%(41/41)，假阳性率为2.4%(1/42)，假阴性率为0%(0/18)。

BCOP方法对于阳性结果的预测，总敏感性为100%(18/18)，其中严重/腐蚀性刺激性预测，敏感性为100%(2/2)，对于中度-轻度刺激性的区分，敏感性为95.8%(14/16)。BCOP可以区分35种无刺激性样品，特异性为83.3%(35/42)。总的分类一致性达到85%(51/60)，其中阳性预测性(含轻度,中度和严重刺激性)为72%(18/25)，阴性预测性为100%(35/35)。假阳性率为20.0%(7/35)，假阴性率为0%(0/18)。分类不一致的情况是将1种轻度和1种中度刺激性误分类为严重刺激性，7种无刺激性误分类为轻-中度刺激严重刺激性。

试验结果表明，CAMVA区分了41种无刺激性样品，18种有刺激性样品，与兔眼试验一致性达到98.3%(59/60)，但对于有刺激性样品并无确切的程度对应区分。BCOP鉴别了35种无刺激性样品和25种有刺激性样品，总的分类一致性为85%，一致性检测Kappa=0.743，低于CAMVA法，主是原因是BCOP方法将较多的无刺激类归为不可预测类。采用CAMVA-BCOP的组合方法(表2)：对于阳性结果的预测总敏感性为100%(18/18)，其中严重刺激性预测敏感性为100%(2/2)，对于中度-轻度刺激性的区分，敏感性为100%(15/15)，对于无刺激性样品预测的特异性为97.6%(41/42)。总的分类一致性达到98.3%(59/60)，其中阳性预测性为100%(18/18)，阴性预测性为100%(35/35)。假阳性率为2.4%(1/42)，假阴性率为0%(0/18)。

表1 体内和体外实验结果

表2 组合方法实验结果

图1 组合CAMVA-BCOP方法的眼刺激试验策略

3 讨论

传统Draize兔眼试验存在评分主观性、重复性差、耗时、方法残忍等不足，无法满足产品精确定量评价的要求。近20多年来，已开发了多种体外方法用于替代兔眼试验，不仅可以减少体内试验的不足，而且遵循了动物实验减少优化和替代的3R原则。但是，鉴于体内眼刺激反应尚包括眼睑、结膜和角膜的反应，仅使用单一体外方法无法完全模拟体内反应，不同方法适用范围也存在差异，体外方法还不能很好地检测损伤后的修复作用。因此考虑组合两个或两个以上体外方法建立整合测试策略，以覆盖眼刺激性反应累及的范围和程度。

鸡胚绒毛膜毛尿囊膜结构与眼结膜相似，CAMVA方法通过观察受试物对血管的作用评价潜在的眼刺激性，具有较高的敏感性[6]。对于检测中度以下的眼刺激性效果较好，尤其是能有效区分无刺激性物质[7]，但对轻度刺激性以上的物质无法精确区分。其不足之处还表现在对含聚氧乙烯配方的检测中容易导致假阳性结果[6]，实验持续时间较长，对不溶物质的操作要求较高等。该方法适合作为化妆品和个人护理用品配方、醇类物质和表面活性剂的刺激性筛查[2,5]。

BCOP以离体牛眼角膜模拟人角膜进行受试物暴露，通过测量角膜浑浊度及渗透性的改变评价受试物眼物刺激性[8]。其优点在于不受样品理化性质和溶解性的限制，可用于化学品眼刺激标识和分类，还可以延长角膜培养时间和增加角膜组织学检查以评估刺激损伤后的恢复作用和机制分析。缺点是只评估了角膜损伤，没有考虑受试物对虹膜和结膜的刺激作用[9]。BCOP法于2009年被OECD认可发布为试验指南(TG 437)，用于严重刺激性和腐蚀性的鉴别，2013年重复修订的版本，确定了其在鉴别无刺激性中的作用[4]。

本研究结果表明，采用CAMVA-BCOP的组合方法可明显提高眼刺激性预测的一致性和敏感性，弥补单一方法的不足，达到替代体内实验的目的。如果了解产品成分或配方结构，替代方法的组合应用特别具有优势。如何选择方法组合及其顺序应综合考虑评估目的和样品特性等因素，例如美国EPA推荐采用BCOP法、细胞传感器法和重建角膜模型(EpiOcular)的组合策略，用于抗菌剂眼刺激性的检测[3]。Donahue等人建立了基于化妆品配方优化的CAMVA和BCOP的组合方法[10]。日本学者建立了STE与BCOP方法的组合评价化合物的眼刺激性[11]。本研究建立CAMVA-BCOP整合方案适用于个人护理用品的测试，主要考虑到大部分样品眼刺激性较温和，而且剂型多样，配方多变的特点，实验顺序采用先CAMVA后BCOP的组合。如果是工业化学品，关注的是化学物刺激性的准确标识和分类，眼刺激性波动范围可能较大，可在预判的基础上，选择BCOP单一方法测试或选择先BCOP后CAMVA的组合[12]。根据新版的OECD指南，BCOP可以有效鉴别刺激谱两端的样品，配合敏感性高的CAMVA，这一组合可解决大部分样品眼刺激性检测的需要，建议的测试程序如图1。相信随着更多标准化的眼刺激替代方法的研发，以及针对不同测试目的建立组合方案的探索和验证，有希望进一步提高眼刺激性预测的科学性。

参考文献：

[1] 敖华英, 程树军, 谈伟君. 不同哺乳动物红细胞溶血替代眼刺激实验的比较 [J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(12):2163-2166.

[2] 程树军, 焦红. 实验动物替代方法原理与应用 [M]. 北京: 科学出版社. 2010:285-304.

[3] EPA BRD-Final Report. Background review document of an in vitro approach for EPA toxicity labeling of anti-microbial cleaning products: EPA toxicity labeling background review document [R]. USA: EPA, 2009.

[4] Bagley DM, Waters D, Kong BM. Development of a 10-day chorioallantoic membrane vascular assay as an alternative to the Draize rabbit eye irritation test [J]. Food Chem Toxicol, 1994, 32(12):1155-1160.

[5] OECD. OECD guideline for testing of chemicals No. 437: Bovine corneal opacity and permeability test method for identifying i) Chemicals inducing serious eye damage and ii) Chemicals not requiring classification for eye irritation or serious eye damage [S]. OECD Paris, 2013, 1-27

[6] Bagley DM, Cerven D, Harbell J. Assessment of the chorioallantoic membrane vascular assay (CAMVA) in the COLIPA in vitro eye irritation validation study [J]. Toxicol In Vitro, 1999, 13(2):285-293.

[7] Daniel MB, Perveen YR, Betty MK, et al. Evaluation of the vascular components of the chorioallantoic membrane assay as a model for eye irritation potential: II [J]. Cutan Ocular Toxicol, 1991, 10(1-2):105-113.

[8] Cameron DM, Donahue DA, Costion GE, et al. Confirmation of in vitro and clinical safety assessment of behentrimonium chloride-containing leave-on body lotions using post-marketing adverse event data[J]. Toxicol In Vitro, 2013,27(8):2203-2212.

[9] ICCVAM. Test Method Evaluation Repor: In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM)[R]. NIH Publication : 2007.

[10] Donahue DA, Kaufman LE, Avalos J, et al. Survey of ocular irritation predictive capacity using chorioallantoic membrane vascular assay (CAMVA) and bovine corneal opacity and permeability (BCOP) test historical data for 319 personal care products over fourteen years [J]. Toxicol In Vitro, 2011, 25(2):563-572.

[11] Hayashi K, Mori T, Abo T, et al. A tiered approach combining the short time exposure (STE) test and the bovine corneal opacity and permeability (BCOP) assay for predicting eye irritation potential of chemicals[J] Toxicol Sci. 2012, 37(2):269-280.

[12] 敖华英,程树军,潘芳,等.化妆品眼刺激试验替代方法标准化与展望[J],中国比较医学杂志,2012,22(1):79-83.