北京地区实验动物中嗜肺巴斯德杆菌的表型分析

邢 进，冯育芳，岳秉飞，贺争鸣

(中国食品药品检定研究院 实验动物资源研究所，北京 100050)

嗜肺巴斯德杆菌(Pasteurellapneumotropica, PP)是一种主要感染啮齿类动物的条件致病菌。其主要存在于啮齿类动物的上呼吸道、肺、消化道和泌尿道[1]。一般PP不会影响到免疫功能正常动物的健康，但是会引起免疫缺陷动物严重的肺炎，并可能导致死亡[2，3]。PP是实验动物检测国家标准[4]中SPF级动物必须要排除的病原菌之一。国家标准中对PP的检测方法进行了说明[5]。但是在实际的检测工作中，巴斯德杆菌所属的巴斯德菌科中，放线杆菌属、嗜血杆菌属以及巴斯德菌属的很多菌株都会给鉴别造成困难，经常会遇到难以鉴别的情况。本研究通过对PP的分离株的生化结果进行分析，通过16S rDNA的测序对结果进行验证，改进国家标准中的PP的生化鉴定项目，提高对PP检测的准确性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：嗜肺巴斯德杆菌Heyl型ATCC12555和Jawetz型ATCC35149，购自美国ATCC。采用国家标准分离鉴定的306株PP分离株，小鼠258株，大鼠39株，豚鼠3株，沙鼠6株。

1.1.2 试剂：OXIOD哥伦比亚血琼脂培养基；BD革兰氏阴性菌生化鉴定板，梅里埃氧化酶试剂；PP诊断血清由本实验室制备。Qiagen DNA提取试剂盒；PCR和琼脂糖电泳相关试剂购自宝生物工程(大连)公司。

1.1.3 主要仪器：上海安亭WGP-600隔水式恒温培养箱，BD Phoenix100全自动细菌鉴定仪， ABI Verit PCR仪。

1. 2 方法

1.2.1 菌株鉴定：所有菌株接种于5%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂平皿，置37℃培养48 h。观察菌落的大小、颜色、溶血特性等表型特征。

1.2.2 生化鉴定：所有菌株在血琼脂平皿上37℃培养16 h，培养物用BD的革兰氏阴性细菌鉴定板进行生化鉴定，其生化项目与国家标准中的生化项目、菌落颜色、溶血特性合并组成表型谱，共53个特征数据，应用Bionumerics 3.0软件进行聚类分析。

1.2.3 DNA测序：受试菌株基因组DNA用Qiagen提取试剂盒提取。参考Weiburg[6]的方法，对16S rDNA进行扩增，产物送上海生工测序，测序结果在NCBI中进行Blast比对，取得16S rDNA鉴定结果。

1.2.4 生物型区分：Jawetz和Heyl型的鉴别参考Benga等[7]设计的多重PCR方法，针对巴斯德菌属16S-23S间隔区，分别设计巴斯德菌属，Jawetz型和Heyl型的特异性引物，见表1。对生化鉴定和测序结果为阳性的菌株进行多重PCR，反应体系为20 μL，其中10× buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(2.5 mM)1.6 μL，TaqHS酶(5 U/μL)0.2 μL，PastF、PastR和HeylR(均10 μmol/L)各0.5 μL，JawR(10 μmol/L)0.4 μL，菌株模板DNA 2 μL，ddH2O 12.3 μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min, 58℃退火30 s, 72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃ 延伸4 min。

表1 巴斯德菌属，Jawetz型和Heyl型特异性引物

2 结果

2.1 菌株鉴定

2.1.1 生化和菌落特征鉴定:所有306菌株分离株按照国家标准鉴定符合PP阳性条件。其中轻微a溶血菌株有70株，用棉签刮取菌落，颜色灰白色的有35株，黄色的有189株。使用BD自动细菌鉴定系统进行再次鉴定，有164株鉴定为PP。

2.1.2 16 S rDNA测序鉴定:经16S rDNA的测序，与NCBI上BLAST比对后又确定有63株为PP。结合菌落形态、生化反应以及16S rDNA测序结果综合分析，排除BD细菌鉴定仪鉴定结果中2株假阳性。在306株可疑PP分离株中共确定真阳性菌株227株。不同动物分离株生化和测序鉴定结果真阳性比例见表2。

表2 分离自不同动物嗜肺巴斯德杆菌生化鉴定和16S rDNA测序鉴定结果

227株真阳性菌株主要生化项目阳性率，见表3。其中国家标准中要求的几项生化试验：氧化酶、过氧化氢酶、硫化氢、硝酸盐均为阳性，动力和明胶液化均为阴性，尿素阳性率95.2%，靛基质阳性率5.3%。其中靛基质为阳性的菌株以Jawetz生物型居多，占52.6%(10/19)，Heyl生物型只有21.1%(4/19)。在国家标准外的生化试验：ONPG全部为阳性；麦芽糖、鼠李糖、山梨醇和七叶苷全部为阴性；另外磷酸盐和醋酸盐试验阳性率分别为98.2%和1.3%。

在之前分离的306株菌株中，鉴定出与PP相似的菌株有产气巴斯德杆菌(Pasteurellaaerogenes)22株、林氏放线杆菌(Actinobacilluslignieresii)15株和小鼠放线杆菌(Actinobacillusmuris)10株。

表3 227株嗜肺巴斯德杆菌主要生化反应阳性率

1、17：100bp DNA marker；2～6：Jawetz型，分别为PP、PP、PP、PP、PP；7～11：Heyl型，分别为PP、PP、PP、PP、PP；12～16：其他(非Jawetz和Heyl型)，分别为PP、PP、PP、PP、PP；18：ATCC12555；19：ATCC35149；20：空白对照。

2.2 生物型和表型聚类分析

16S-23S rRNA间隔区PCR结果显示，227株PP分离株中， Heyl型有184株，Jawetz型有24株，不能区分的有19株，见表4、图1。根据表型特征聚类分析结果，在北京地区实验动物中，Heyl生物型的污染占绝大多数，分离自16个来源，其以菌苔微黄为特征，并多伴有轻微的a溶血。其中有个分离源同时存在Jawetz型菌株的污染。

PP077和PP277的表型特征与标准菌株ATCC12555(Heyl型)的完全相同，先后分离自两个不同的单位。结果中未发现与标准菌株ATCC35149(Jawetz型)表型相同的菌株，24株Jawetz型分离株与ATCC35149标准株的相似性仅有65%～74%。

表4 227株嗜肺巴斯德杆菌生物型

经Bionumerics 3.0软件分析，227株PP的表型特征共有140种，其中184株Heyl型有106种，24株Jawetz型有23种，19株不能确定生物型的菌株表型均不相同，但有8种与Heyl型相符，如图2。

图2 嗜肺巴斯德杆菌表型特征与生物型的分布

3 讨论

本研究中，有4株分离株没能复苏成功，未能鉴定，其余菌株均获得53项表型特征鉴定结果。结合生化反应、表型特征、PCR和16S rDNA测序，最终确定PP的真阳性菌株比例74.2%。对受试菌株表型特征的聚类分析发现北京地区实验动物中的PP表型丰富多样，增加了常规分离鉴定的难度。

国家标准中的PP靛基质给出的参考是阴阳性均有可能，本研究发现在北京地区分离到的菌株中，靛基质阳性率仅为5.3%，以Jawetz生物型居多。提示在检测中，当其他生化项目相符时，靛基质阳性、菌苔为灰白色的菌株应考虑为PP的Jawetz生物型菌株。

由于目前国家标准中对PP的鉴定程序中的生化项目有限，血清凝集反应也会存在假阳性，当遇到菌落形态等表型特征与PP常接近的菌株时，容易造成与PP的混淆，造成假阳性的出现。因此有必要在检测标准中增加生化鉴定项目，并引入分子生物学鉴定方法对检测结果实施验证。

16S rDNA的测序比对结果为Pasteurellaceaegen. sp. Forsyth A3的有33株，占比例较高，根据16S rDNA的聚类结果，其序列与PP标准菌株ATCC35149的相似性为30%左右，与ATCC12555的相似性为97%左右。序列的相似性表明这些菌株很可能是Heyl型嗜肺巴斯德杆菌的野生型菌株。此类菌株应如何确定归属有待从微进化角度进一步研究。

参考文献：

[1] Sasaki H, Kawamoto E, Tanaka Y, et al. Comparative analysis ofPasteurellapneumotropicaisolates from laboratory mice and rats [J]. Antonie van Leeuwenhoek. 2009, 95(4):311-317.

[2] Macy JD Jr, Weir EC, Compton SR, et al. Dual infection withPneumocystiscariniiandPasteurellapneumotropicain B cell-deficient mice: diagnosis and therapy [J]. Comp Med, 2000, 50(1):49-55.

[3] Hart ML, Mosier DA, Chapes SK. Toll-like receptor 4-positive macrophages protect mice fromPasteurellapneumotropica-inducedpneumonia [J]. Infect Immun, 2003, 71(2):663-670.

[4] GB 14922.2-2001. 实验动物微生物学等级及监测 [S]. 国家质量监督检验检疫总局. 2011.

[5] GB/T 14926.12-2001. 实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测方法 [S]. 国家质量监督检验检疫总局. 2001.

[6] Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study [J]. J Bacteriol, 1991, 173(2):697-703.

[7] Benga L, Benten WP, Engelhardt E, et L. Development of a multiplex PCR assay based on the 16S-23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodentPasteurellaceae[J]. J Microbiol Methods. 2013, 95(2):256-261.