扶肾降浊方含药血清对肾小管间质损害大鼠成纤维细胞TGF-β1/Smads信号转导通路的影响*

李春雨， 苏玮莲， 魏晓露， 李国霞

(天津医科大学国际医学院，天津 300070)

肾小管间质损害是肾小球肾炎由炎症启动进展至肾小球硬化的中间环节，肾小球肾炎进展至肾小球硬化，大多已不可逆转，而对其中间环节即肾小管间质损害进行早期有效干预则可大大延缓肾小球肾炎进展，对防治慢性肾脏疾病具有重要意义[1-2]。扶肾降浊方在临床广泛用于慢性肾脏疾病的治疗，多年的临床实践表明，总有效率达82.5%[3]。动物实验表明，扶肾降浊方能改善慢性肾功能衰竭大鼠的常规生化指标，延缓肾衰的病理进程[4]。但对肾小管间质损害的保护作用机制尚不十分清楚。本文采用血清药理学的研究方法，基于转化生长因子-β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)/Smads信号转导通路，从体外细胞实验角度，探讨扶肾降浊方对系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)肾小管间质损害的保护作用机制。

材 料 和 方 法

1 药物与试剂

扶肾降浊方组成：山茱萸12 g，生黄芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹参30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，实验所用中药制剂为天津中医药大学中药学院按既定工艺制备的配方颗粒，每克含生药4.06 g，批号：20120810；葡萄球菌肠毒素B由军事医学科学院微生物流行病研究所提供；完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为Sigma产品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)为Amresco产品；Trizol reagent、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自天根生化科技有限公司；全蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE试剂盒、Western blotting检测试剂盒和ECL化学发光底物试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

2 动物

雄性Wistar大鼠20只，体重(150±10)g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供，合格证号为SCXK(军)2009-003。

3 仪器

Leica DMI 4000B倒置荧光显微镜(德国徕卡公司)；电泳仪(大连竞迈生物科技有限公司)；DH-2000凝胶图像采集分析系统(Heraeus)；ABI 7500型实时荧光定量基因扩增仪(美国应用生物系统公司)。

4 方法

4.1含药血清制备 6只Wistar大鼠随机分为：扶肾降浊方组(3只)和空白对照组(3只)。扶肾降浊方组以生药51.5 g/kg剂量(成人剂量的15倍)灌胃给药，每日2次，空白对照组给予等体积生理盐水。连续3 d，于末次给药后1 h腹主动脉取血，静置30 min，3 000 r/min 离心20 min分离血清，56 ℃水浴30 min灭活补体，0.22 μm滤膜除菌，-20 ℃保存备用。

4.2病理状态间质成纤维细胞培养 复制MsPGN大鼠动物模型[5-6]：6只Wistar大鼠随机分为：模型组(3只)和空白对照组(3只)，自实验第1天起，模型组大鼠以BSA水溶液配成隔日灌胃1次，空白对照组大鼠给予等体积生理盐水隔日灌胃1次，共12至20周。实验的第1天模型组分点注射完全弗氏佐剂0.2 mL(含BSA 2 mg),第8天注射不完全弗氏佐剂0.2 mL(含BSA 2 mg)，实验的第8、15天尾静脉注射金黄色葡萄球菌肠毒素B(0.4 mg/kg,配成水溶液)各1次。空白对照组注射等体积生理盐水。经病理组织学(Masson染色)证实本实验MsPGN大鼠动物模型复制成功。取第12、16和20周的模型大鼠肾间质成纤维细胞进行培养，同时培养正常大鼠肾间质成纤维细胞作为空白对照。无菌条件下，将富含小管间质的肾组织剪碎成1 mm×1 mm×1 mm小块，经PBS洗涤，胰蛋白酶消化，调整细胞密度至1.0×109/L后接种于含10%胎牛血清DMEM培养皿中，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，将细胞以密度1.2×109/L接种于6孔培养板，分为5组：空白对照组(正常间质成纤维细胞)、模型对照组和含药血清低、中、高剂量组(分别为5%、10%和20%扶肾降浊方含药血清)，每组设3个复孔，各组细胞继续培养12 h，加入含药血清(空白对照和模型对照组加入20%对照血清)作用48 h后进行相关指标检测。

4.3Real-time PCR Trizol法提取总RNA，按照试剂盒说明书进行cDNA合成。以反转录产物为模板，引物序列见表1，进行real-time PCR反应。反应体系为20 μL：2×Super Real PreMix Plus 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，模板(反转录产物)1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.4 μL。反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s；50～60 ℃退火/延伸30 s；循环40次。反应结束后自动生成熔解曲线，结果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法对目的基因进行相对定量分析[7-9]。

表1 引物序列

4.4Western blotting 蛋白变性后在10% SDS-PAGE中分离，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Ⅰ抗4 ℃摇床振荡孵育过夜，第2天回收Ⅰ抗，TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min，加入Ⅱ抗，室温摇床振荡孵育2 h，ECL化学发光法显影，Gel-Pro 3.2软件对结果进行灰度分析。

5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，用单因素方差分析法进行组间比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 扶肾降浊方含药血清对肾间质成纤维细胞TGF-β1/Smads信号通路mRNA表达的影响

MsPGN大鼠肾小管间质损害后体外培养肾间质成纤维细胞，模型组与对照组比较，TGF-β1和Smad3 mRNA表达上调(P<0.05)，Smad7 mRNA表达下调(P<0.05)。随着造模周期的延长，5%扶肾降浊方含药血清在第20周以及10%含药血清在第16和20周以及20%含药血清在第12、16和20周均可明显下调成纤维细胞TGF-β1和Smad3 mRNA表达(P<0.05)，上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)，但无明显的时间依赖性，见表2～4。

表2 扶肾降浊方含药血清对肾间质成纤维细胞TGF-β1 mRNA表达的影响

表3 扶肾降浊方含药血清对肾间质成纤维细胞Smad3 mRNA表达的影响

表4 扶肾降浊方含药血清对肾间质成纤维细胞Smad7 mRNA表达的影响

2 扶肾降浊方含药血清对肾间质成纤维细胞TGF-β1/Smads信号通路蛋白表达的影响

MsPGN大鼠肾小管间质损害后体外培养间质成纤维细胞，模型组与对照组比较，TGF-β1和Smad3蛋白表达上调(P<0.05)，Smad7蛋白表达下调(P<0.05)。5%、10%和20%扶肾降浊方含药血清在第12、16和20周能明显下调成纤维细胞TGF-β1和Smad3蛋白表达(P<0.05)，上调Smad7蛋白表达(P<0.05)，但无明显的时间依赖性，结果见图1～3。

Figure 1. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 12 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3.△P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs model group.

讨 论

TGF-β1是肾小球硬化和肾小管间质纤维化的关键因素，TGF-β1可直接促进肾小管细胞和间质纤维细胞合成胶原、纤维连接蛋白和层黏连蛋白；介导肾素血管紧张素、血小板生长因子、结缔组织生长因子的致纤维化作用。急慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病、肾移植排斥反应、多囊肾和间质性肾炎等纤维化进程均与TGF-β1的高表达有关。因此，有效地切断TGF-β1的信号通路，是中止或减轻肾纤维化进程的关键环节[10]。Smads蛋白是TGF-β家族信号从受体到核的细胞内转导分子，TGF-β1通过其Ⅰ型和Ⅱ型受体完成信号转导，以激活其下游Smads信号分子的磷酸化，随后引起核转位，进而调控基因的表达。Smads家族中Smad2～4、Smad6和Smad7参与TGF-β的信号转导[11]。Smad3是目前所知唯一TGF-β1受体的胞内激酶底物，介导了TGF-β1的胞内信号转导。Smad7是具有负反馈调节TGF-β1功能的细胞分泌因子，是TGF-β1特有的内源性抑制因子，其表达的调控是阻断肾小球TGF-β1效应的关键环节[12-13]。我们前期研究发现，扶肾降浊方干预肾小管间质损害造成的肾组织TGF-β1/Smads/ILK信号转导通路基因和蛋白表达异常，负性调节肾小管上皮细胞间质转分化，减少炎细胞的浸润与减轻肾小管间质和肾小球损伤，延缓肾小管间质损害病程的进展。本研究探讨了扶肾降浊方含药血清对病理状态间质成纤维细胞TGF-β1/Smads信号转导通路mRNA和蛋白表达的影响，以期进一步从体外细胞实验角度阐明该方对肾小管间质损害的保护作用机制。

Figure 2. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 16 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group.

本研究发现，MsPGN大鼠发展为肾小管间质损害后，体外培养病理状态间质成纤维细胞，TGF-β1/Smads信号转导通路发生改变，其中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达上调，Smad7 mRNA和蛋白表达下调。随着造模周期的延长，扶肾降浊方含药血清能部分逆转肾小管损害造成的上述mRNA和蛋白表达的异常，提示扶肾降浊方含药血清可通过抑制TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的过度表达，增加Smad7 mRNA和蛋白表达，可能是其发挥保护肾小管间质作用的机制，本研究为中医药防治慢性肾功能衰竭提供了新的思路。

Figure 3. Expression of proteins in renal interstitial fibroblasts in 20 weeks detected by Western blotting.1: control group; 2: model group; 3: 5% drug-containing serum group; 4: 10% drug-containing serum group; 5: 20% drug-containing serum group.Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group;*P<0.05 vs model group.

[参 考 文 献]

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