真武汤对肾间质纤维化大鼠纤维连接蛋白和基质金属蛋白酶9表达的研究

周波，宋立群，贠捷，张丹萍，宋业旭，马艳春，陈方明

(1.四川省达州市中西医结合医院，四川 达州 635002;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;4.四川省达州市畜禽繁育改良站，四川 达州 635000)

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各种肾病进展到终末期肾病的基础，RIF的发生涉及炎性细胞浸润、肾小管损伤、肾间质成纤维细胞的增殖、细胞外基质过度沉积等过程［1］，我们的研究结果与此相符。纤维连接蛋白(FN)是肾间质纤维化的一个重要蛋白酶，基质金属蛋白酶9(MMP－9)是细胞外基质蛋白降解酶之一，能够降解完整的基底膜，最终导致肾间质纤维化的形成。本研究将探讨真武汤对肾间质纤维化模型大鼠肾组织FN和 MMP－9蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 动物和药品

SPF级Wistar雄性健康大鼠150只，由黑龙江中医药大学提供，体质量为180～200g。真武汤所需饮片由黑龙江中医药大学附属第一医院提供;尿毒清颗粒(广州康臣药业有限公司)。

1.2 主要实验仪器

切片机(德国Leica公司，2135型);光学显微镜(日本，OLYMPUS);成像系统(美国 moticam公司，Moticam3000型);图像分析软件(麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.3 肾间质纤维化模型制作

将150只大鼠常规饲养1周，10%水合氯醛麻醉，常规备皮、消毒，以左侧肋腰点为手术切口，将左侧肾脏及肾蒂充分暴露，仔细分离出输尿管，将输尿管结扎，假手术组不结扎输尿管，余同模型组，逐层缝合并消毒。

1.4 实验分组

将150只大鼠随机分为假手术组和模型复制组，将模型复制后的大鼠随机分为模型组、真武汤低剂量组、中剂量组、高剂量组和尿毒清组，其中假手术组和模型组21只，其余各组27只。

1.5 给药剂量及方法

真武汤组方和剂量参考《方剂学》(第五版)教材，低、中、高剂量组分别为 7g/(kg·d)、14g/(kg·d)、28g/(kg·d)，尿毒清颗粒:根据文献剂量为3.75g/(kg·d)。从术后第1天开始给药，每天灌服1次，假手术组和模型组给予等量的生理盐水，分别连续灌服2周、3周和4周。

1.6 标本收集及检测

实验分为给药2周、3周和4周三个时间点进行研究，于给药后的第2周、3周、4周末随机处死并取材，假手术组和模型组各6只，其余各组8只，收集肾脏组织标本，常规固定，石蜡包埋，采用HE染色法进行检测，以百分比评分法对梗阻侧肾脏进行肾小管损伤和肾间质纤维化程度进行评估，每组分别选取10个高倍视野(×400)，计算肾小管损伤比例;采用美国Motic image 3.2图像分析系统对肾间质纤维化程度分析和评估。

1.7 统计学处理

2 实验结果

2.1 各组肾脏组织FN蛋白表达比较

假手术组肾小管上皮细胞有少量FN蛋白的表达，模型组的肾小管上皮细胞和间质细胞可见FN蛋白的阳性表达，差异具有统计学意义，模型组FN蛋白的表达随着研究时间的延长而逐渐增强，与模型组比较，各药物组FN的蛋白表达均低于模型组，差异具有统计学意义，各组FN蛋白表达趋势与模型组一致，各药物组中，真武汤中剂量组FN蛋白的表达最弱，真武汤中剂量组与尿毒清组蛋白表达水平一致。结果见表1和图1。

2.2 各组肾脏组织MMP－9蛋白表达比较

假手术组可见少量MMP－9蛋白的表达，模型组可见大量MMP－9蛋白的阳性表达，差异具有统计学意义，与模型组比较，各药物组MMP－9的蛋白表达均低于模型组，差异具有统计学意义，各组MMP－9蛋白表达趋势与模型组一致，各药物组中，真武汤中剂量组MMP－9蛋白的表达最弱，真武汤中剂量组与尿毒清组蛋白表达水平一致。结果见表2和图2。

表1 各组肾组织FN免疫组化表达量(s，平均光密度×10－2)

表1 各组肾组织FN免疫组化表达量(s，平均光密度×10－2)

注:与假手术组比较，aP ＜0.05，bP ＜0.01;与模型组比较，dP ＜0.05，eP ＜0.01;与真武汤中剂量组比较，fP ＞0.05。

组别 视野数 2周 3周 4周假手术组10 11.04 ±1.00 11.12 ±1.03 11.08 ±0.98模型组 10 14.38 ±1.36a 17.63 ±1.57b 20.57 ±1.91b低剂量组 10 12.83 ±1.15d 15.18 ±1.37d 16.34 ±1.45d中剂量组 10 12.11 ±1.08d 13.64 ±1.21e 14.22 ±1.21e高剂量组 10 13.36 ±1.12d 14.56 ±1.35d 15.43 ±1.20d尿毒清组 10 12.05 ±1.10d☆ 13.65 ±1.26ef14.05 ±1.20ef

表2 各组肾组织MMP－9免疫组化表达量(s，平均光密度×10－2)

表2 各组肾组织MMP－9免疫组化表达量(s，平均光密度×10－2)

注:与假手术组比较，aP ＜0.05，bP ＜0.01，cP ＜0.001;与模型组比较，dP ＜0.05，eP ＜0.01;与真武汤中剂量组比较，fP ＞0.05。

组别 视野数 2周 3周 4周假手术组10 12.26 ±1.15 12.34 ±1.20 12.25 ±1.03模型组 10 16.85 ±1.51a 18.67 ±1.65b 21.36 ±1.92c低剂量组 10 15.63 ±1.34d 16.68 ±1.53d 17.39 ±1.56d中剂量组 10 14.25 ±1.26d 15.13 ±1.28d 15.89 ±1.43e高剂量组 10 15.22 ±1.38d 15.86 ±1.43d 16.57 ±1.51d尿毒清组 10 14.07 ±1.25d☆ 15.02 ±1.35df15.28 ±1.25ef

图1 各组大鼠肾组织FN免疫组化(×400)

图2 各组大鼠肾组织MMP－9免疫组化(×400)

3 讨论

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是由多种细胞及细胞因子共同参与，涉及炎性细胞浸润、肾小管损伤、成纤维细胞的增殖等过程，最终导致细胞外基质过度沉积而形成肾间质纤维化［1－2］，我们的研究结果与此相符，在其他文章中阐述。

FN是重要的细胞外基质蛋白，对纤维蛋白、纤维蛋白原和胶原有较强的结合能力，能够对细胞外基质产生量和质的改变，FN的蛋白表达可以反映细胞外基质的沉积程度，是肾间质纤维化的一个重要标志［3］。MMP－9又称明胶酶，是细胞外基质蛋白降解酶之一，是调节细胞外基质动态平衡的重要酶类主要降解明胶、Ⅳ、Ⅴ等型胶原及层黏连蛋白等，能降解完整的基底膜，最终导致肾间质纤维化的形成［4］。

在本研究中，假手术组可见少量FN和MMP－9蛋白的表达，模型组可见大量FN和MMP－9蛋白的阳性表达，差异具有统计学意义，模型组各时间点内，FN和MMP－9蛋白的表达随着研究时间的延长而逐渐增强，说明梗阻时间越长，FN和MMP－9蛋白的表达越强，肾间质纤维化程度越重，与模型组比较，各药物组FN和MMP－9蛋白表达均低于模型组，具有统计学意义，说明真武汤能够抑制FN和MMP－9蛋白的表达，能够抑制肾间质纤维化的进展，各药物组中，真武汤中剂量组FN和MMP－9蛋白表达最弱，真武汤中剂量组与尿毒清组蛋白表达水平一致。

综上所述，真武汤能够抑制肾间质纤维化大鼠肾组织中FN和MMP－9蛋白表达，从而发挥真武汤延缓或阻断肾间质纤维化的进程，其中真武汤中剂量组的效果最佳。

［1］Boor P，Ostendorf T，Floege J.Renal fibrosis:novel insights into mechanisms and therapeutic targets［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6(11):643－656.

［2］宋立群，马晓鹏，宋业旭，等.差异蛋白组学在中医药防治肾间质纤维化中的应用展望［J］.中医药学报，2013，41(6):90 －92.

［3］Chen Z，Chen D，McCarthy TL，et al.Inorganic phosphate stimulates fibronectin expression in renal fibroblasts［J］.Cell Physiol Biochem，2012，30(1):151 －159.

［4］韩园园，魏仲南.MMP－9/TIMP－1在肾间质纤维化过程中的作用机制及中医药对其干预的研究进展［J］.中国医药指南，2013，11(3):40－41.