不同电针对慢性应激抑郁模型大鼠海马及血清细胞因子IL－1β、IL－6表达的影响

莫雨平，邓晓丰，纪倩，滕金艳，姚海江，宋洪涛，唐银杉，许安萍，张淑静，李志刚

(北京中医药大学，北京 100029)

抑郁症是一种情绪障碍性疾病，临床表现为心境低落，躯体不适和睡眠障碍等持久的抑郁状态，明显影响患者日常生活及社会功能。世界卫生组织(WHO)预测到2020年抑郁症将成为全球第二大威胁人类健康、增加经济负担的疾患［1］。慢性应激模型作为一种有效的抑郁模型，已被广泛应用于抑郁症的基础研究和各种治疗方法筛选［2］。细胞因子同神经递质和激素一样，是免疫系统与中枢神经系统和内分泌系统之间信息交流的重要信息分子，在维持机体内稳定状态以及参与某些病理状态中起着重要的调节作用。它参与机体免疫反应、应激反应和炎症的调节，引起抑郁样的行为异常:如运动迟缓、睡眠障碍、厌食、体重减轻、痛觉过敏、社会退缩、性欲减低等［3］。为此，本研究拟通过孤养结合慢性轻度不可预见性应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)复制抑郁症模型并运用电针进行干预，通过免疫组织化学法和酶联免疫吸附法检测细胞因子IL－1β、IL－6在大鼠海马及血清中的表达情况，以探讨IL－1β、IL－6在大鼠实验性抑郁症发病过程中的作用机制及电针干预对其影响，为临床诊断和防治抑郁症提供新的途径及实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

成年SD大鼠，雄性，60只，体质量(200±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(合格证号:SCXK(京)2012－0001)。温度(25±2)℃，湿度(50±20)%，自然光照，自由进食、进水(除实验要求禁食禁水外)。实验前适应性饲养1周，1周后采用开野试验、糖水试验及体质量测量进行行为学评分，选取得分相近的SD大鼠60只，随机分为5组，每组12只，正常组6只/笼饲养，正常饮食，不给予任何刺激;模型组1只/笼孤养结合慢性轻度不可预见性应激。

1.2 实验仪器试剂

Thermo离心机(美国);Thermo酶标仪(美国);百忧解(美国礼来公司，20mg，批号J20030017);IL－1β、IL－6抗体试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白IgG及SP试剂盒(北京中山生物科技公司);DAB显色试剂盒(北京中山生物科技公司);枸橼酸钠抗原修复液(北京博奥森生物技术有限公司);PBS缓冲液(北京博奥森生物技术有限公司);上海朗顿酶联免疫试剂盒。

华佗牌无菌针灸针(0.30×25mm，天津杏林书院医疗器械有限公司);LH202型韩氏穴位神经刺激仪(北京大学神经科学研究所监制，北京华卫产业开发公司);ZJ－12H音乐电针治疗仪(中国针灸学会研制，深圳市圣祥高科技有限公司)。

2 方法

2.1 孤养结合CUMS模型的建立

本实验采用多种不可预知的刺激方法交替进行，以避免大鼠对单一或有规律的应激刺激产生耐受性，随机接受21天7种不同的应激刺激，平均每种刺激3次。包括禁食(24h)、禁水(24h)、潮湿环境(24h)、冷水游泳(10℃，5min)、夹尾(距尾尖 2cm，5min)、电击(100V，2mA，5min)、摇晃(1 次/s，15min)。

2.2 各组干预方法

步骤参考本课题组前期研究结果［4－6］。

2.3 开野试验

敞箱长×宽×高(100cm×100cm×50cm)，内侧四周壁及箱底面均为黑色，底面用白线划分为面积相等的25方格。操作步骤参考本课题组前期研究结果［4－6］，但将观察时间由 3min 延长至5min。

2.4 免疫组织化学法检测大鼠海马IL－1β、IL－6表达情况

具体操作步骤严格按照说明书进行，一抗抗体浓度 IL －1β(1∶50)、IL －6(1∶100)。

2.5 酶联免疫吸附法检测大鼠血清IL－1β、IL－6表达量

大鼠于铡刀快速断头，离心管取血，室温下静置20min，待血液凝固后4℃低温高速离心机4000rpm/min离心10min，移液器分离血清至1.5ml的离心管，－80℃冰箱保存，待测。严格按照上海朗顿酶联免疫试剂盒操作步骤进行大鼠血清IL－1β、IL－6检测。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 各组大鼠开野实验结果比较

如图1所示，21天应激刺激后，与空白组比较，模型组水平运动及垂直运动均明显减少(P＜0.01)，说明造模成功。与模型组比较，百忧解组与两个电针组活动度均明显升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，说明百忧解和两种电针均有抗抑郁作用。

3.2 各组大鼠血清IL－1β、IL－6表达情况比较

如图2所示，与空白组比较，模型组大鼠血清IL－1β、IL－6表达水平升高(均 P ＜0.01);与模型组比较，百忧解组、电针组(P＜0.05)、音乐电针组IL－1β表达水平明显下调(P＜0.05)，但三个治疗组之间无统计学差异。与模型组比较，百忧解组IL－6表达水平有明显下调趋势(P＜0.01)，电针组与音乐电针组IL－6表达也呈现下降趋势，但无统计学差异，三个治疗组之间的差异也无统计学意义。

3.3 各组大鼠海马内IL－1β、IL－6表达情况比较

如图3所示，与空白组比较，模型组大鼠海马内IL－1β、IL－6表达水平升高(均 P ＜0.01);与模型组比较，百忧解组(P＜0.05)、电针组、音乐电针组IL－1β表达水平下调;与百忧解组比较，音乐电针组大鼠海马内IL－1β下调幅度稍低(P≤0.05)。与模型组比较，百忧解组 IL－6表达水平有下调趋势(P＜0.05)，电针组与音乐电针组IL－6表达也呈现下降趋势，但无统计学差异，三个治疗组之间的差异也无统计学意义。

图1 各组大鼠开野实验水平运动及垂直运动次数比较(s，n=12)

图2 各组大鼠血清IL－1β、IL－6表达情况比较(s，n=6)

4 讨论

本实验采用孤养与CUMS结合的方法复制抑郁模型，具有应激因子多变及不可预见的特点，与人类抑郁症发生发展的机制较为接近。应激后模型组大鼠活动减少，探索兴趣降低，说明抑郁症模型复制成功，经典阳性药百忧解及两组电针均能逆转此变化，有抗抑郁的作用，可进行下一步机制分析。

海马与学习、记忆、行为和情绪关系密切，也是应激损伤的重要靶点［7］。细胞因子是一类主要由活化免疫细胞分泌的具有重要生物学特性的小分子蛋白或多肽，是神经－免疫－内分泌调节网络的重要调节因子［8］。细胞因子除了介导免疫细胞互相传递信息外，还可能在抑郁症发病机制中起重要作用。Owen等［9］发现，抑郁症与IL－1β产生增加相关，并且他认为是抑郁导致IL－1β增加，IL－1β是抑郁症的一个特异性指标。因为无论是心因性还是躯体反应性抑郁，外周和中枢的IL－1β增加和炎症反应系统的激活，都可引起抑郁症状或抑郁症。Maes等［10］认为，各种免疫反应和急性期反应的基础是单核细胞分泌IL－6的增加，同时还可导致HPA轴活动过度及5－HT代谢障碍，进而出现疾病症状(如嗜睡、乏力、食欲减退、抑郁等)和植物神经系统症状(如出汗、心慌等)。Kagaya等［11］研究发现，抑郁症患者血浆中的 IL－1β、IL－6浓度均显著高于正常健康人;蔡巍等［12］研究报道，抑郁症患者血清中IL－1β、IL－6水平较正常健康人要明显升高，经过治疗后，随着患者症状的改善，相应的细胞因子水平也下降，进一步说明细胞因子的激活可能是抑郁症发病原因之一［13－15］。

图3 各组大鼠海马内IL－1β、IL－6表达情况比较(s，n=6)

中医学认为，抑郁症发病的病机是脏气受损，髓海亏虚，神机紊乱。印堂、百会为督脉之穴，督脉行于身后，循脊入脑，其布在身，其用在神，其本在脑，本着“经脉所过，主治所及”，选取督脉治疗与脑相关的神志病符合中医治病必求其本之说。此外，印堂穴具有调神醒脑的功效，百会穴为督脉与手足三阳经及足厥阴肝经交会之穴，选取该两穴来治疗抑郁症，可以调节其髓海机能，增进其“五脏化气”的生理功能，使其紊乱的神机恢复正常，以达到抗抑郁的效果［4－6］。

电针疗法是在我国传统针灸治疗基础上发展而来，脉冲电针仪发出周期性重复的波形，用以加强针感，具有针刺和电场的双重作用，但在治疗后期因机体对其适应而出现效果衰减，这一直是困扰电针的一大难题［16－17］。为了彻底摆脱脉冲电针的弱点，更好地提高电针服务临床的疗效，波型参差不齐但均和谐的音乐电针仪应运而生，音乐电针就是将电针治疗与音乐治疗两者合而为一的方法，克服了机体耐受这一缺点［16－17］。另外，音乐也具有镇静、安神、舒缓情绪的作用。《内经》中说“五脏之象，可以类推，五脏相音，可以意识”。古人在长期的实践及体验中，发现音乐与脏气之间有共鸣、互动的关系，不同调式的音乐分别影响着人体相应的脏腑。音乐电针的处方即是运用了中医阴阳五行学说，以五音应五脏及“五音疗疾”的原理创作而成，便于辨证施“乐”［4－6］。

本实验结果显示，两种电针疗法在改善抑郁模型大鼠行为学方面与百忧解疗效一致，说明电针治疗抑郁模型大鼠效果不输于经典抗抑郁药物;抑郁大鼠血清及海马内IL－1β、IL－6的含量高于正常组，两组电针组与百忧解组均能下调IL－1β、IL－6的含量，改善模型大鼠抑郁状态，但两组电针组无统计学差异。分析原因如下:大鼠与人相比，属低级动物，音乐电针的音乐治疗对其效果不突出，只是频率和波形较普通脉冲电针有所区别，仅仅克服了普通脉冲电针容易造成患者耐受或穴位不敏感这一缺点，音乐治疗的优势并未充分体现。若将实验设计于临床展开，音乐电针的治疗作用可能会更加突显。作为危害人类身心健康的高发病率、常见病种之一的抑郁症，病程长，易复发等是其特点，目前主要以药物治疗或控制为主。但临床常用的抗抑郁药物抗抑郁谱窄，毒副作用大。而电针治疗抑郁症是立足于整体调节，副作用低，可以作为治疗抑郁症的方法逐渐应用临床。

［1］Kupfer DJ.Research in affective disorders comes of age［J］.Am J Psychiatry，1999，156(2):165 －167.

［2］李晓秋，许晶.抑郁动物模型的研究进展［J］.中华精神科杂志，2002，35(3):184 －186.

［3］Haack M，Hinze Selch D，Fenzel T，et al.Plasma levels of cytokines and soluble cytokine receptors in psychiatric patients upon hospital admission effects of confounding factors and diagnosis［J］.Joumal of Psychiatric Research，1999，33:407 －418.

［4］纪倩，唐银杉，李志刚，等.不同电针刺激对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及海马谷氨酸转运体的影响［J］.针刺研究，2013，28(3):202－208.

［5］纪倩，梅旭辉，李志刚，等.音乐电针和脉冲电针对慢性应激抑郁大鼠行为学和海马星形胶质细胞的影响［J］.中华中医药杂志，2013，28(3):648 －651.

［6］唐银杉，李志刚，陈万顺，等.音乐电针和脉冲电针对快速老龄化SAMP8小鼠行为学和血清A蛋白的影响［J］.中医药学报，2014，42(1):87－90.

［7］Drevets WC，Price JL，Furey ML.Brain structural and functional abnormalities in mood disorders:implications for neurocircuitry models of depression［J］.Brain Struct Funct，2008，213(1/2):93 －118.

［8］李丽萍，华金双，孙忠人，等.艾灸百会和太冲穴对慢性应激抑郁模型大鼠细胞因子的影响［J］.中医药学刊，2006，24(9):1757－1759.

［9］Owen BM，Eccleston D，Ferrier IN，et al.Raised levels of plasma interleukin － 1beta in major and postviral depression［J］.Acta Psychiatr Scand，2001，103(3):226 －228.

［10］Maes M，Meltzer HY，Scharpe S，et al.Relationships between lower plasma L－tryptophan levels and immune－inflammatory variables in depression［J］.Psychiatry Res，1993，49(2):151 －165.

［11］Kagaya A，Kugaya A，Takebayashi M，et al.Plasma concentrations of interleukin－1beta，interleukin －6，soluble interleukin －2 receptor and tumor necrosis factor alpha of depressed patients in Japan［J］.Neuropsychobiology，2001，143(2):59 －62.

［12］蔡巍，王战坤，黄淑如，等.路优泰对抑郁症患者血清细胞因子的影响［J］.中国中西医结合杂志，2003，23(11):864 －865.

［13］艾群，张红，苗裕.加味六君子汤对抑郁大鼠行为学及白细胞介素1β和白细胞介素6的水平调整［J］.中国临床康复，2006，10(47):55－57.

［14］苗裕，艾群.脾俞、足三里穴位注射对抑郁大鼠行为学及细胞因子 IL－1β、IL－6的影响［J］.中国康复医学杂志，2007，22(8):696－698.

［15］苗裕，艾群，崔晓冬.手十二井穴刺络放血抑郁大鼠血浆白细胞介素1β、白细胞介素6及行为学的指标变化［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11(36):7161 －7164.

［16］张缙，张忆虹，白妍.音乐电针的研究［J］.中国针灸，2005，25(8):585－588.

［17］东红升，裴浩，东贵荣.音乐电针和脉冲电针镇痛作用的对比性研究［J］.针刺研究，2005，30(2):83－87.