补阳还五汤对脑缺血后大鼠NF－κB/p50表达的影响

郭乐，周赛男，蔺晓源，易健，郭纯，刘柏炎，蔡光先

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学省部共建中医内科学教育部重点实验室，湖南 长沙 410007)

脑血管疾病患者轻则遗留残疾，重则失去生命，绝大多数需终生治疗，让医者在治疗上感到非常棘手。我国每年治疗费用中用于脑卒中多达数百亿元，缺血性脑血管病(ICVD)占用其中很大一部分。近些年，脑缺血后大脑炎症反应的作用机制方面的研究受到重视，其中核转录因子(NF－κB)在脑梗死等非病原微生物性炎症损伤中的作用引起了学术界的关注［1］。补阳还五汤对脑缺血炎症反应抗炎效果明显，抗炎机制受到关注，因此深入研究补阳还五汤是如何有效的减轻炎症损伤的作用机制有重要的意义。本实验将补阳还五汤作为研究对象，探讨了补阳还五汤多时间点长时间段对ICVD神经功能的保护作用，并观察其对脑缺血后NF－κB的影响。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD大鼠，雄性，体质量(280±20)g，共180只，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，动物许可证号:SCXK(湘)2009－0004，动物合格证号:004535。

1.1.2 药物 补阳还五汤处方来源于王清任所著的《医林改错》，处方组成:黄芪 120g，当归 6g，赤芍4.5g，芍药 3g，地龙 3g，红花 3g，桃仁 3g。药材购自湖南省药材公司，经湖南中医药研究院鉴定均符合《中国药典》有关规定。补阳还五汤的制备:先用清水浸泡30min，第一煎加药材5倍体积的蒸馏水，煎汁30min，第二煎5倍体积蒸馏水，煎汁30min，两煎混合，浓缩至含生药2g/mL，冷藏备用。米诺环素(惠氏制药有限公司，国药准字号 H10960010，批号2009077)。

1.1.3 主要试剂 水合氯醛(中国上海白鹤化工厂);鼠抗鼠NF－κB/p50单克隆抗体(abcam公司);PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐，美国sigma公司);DMSO(二甲基亚砜，北京索莱宝有限公司);PDTC用DMSO溶解，再用生理盐水稀释;AEC显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司);SABC试剂盒(北京中衫金桥生物技术有限公司)。

1.1.4 主要仪器 自动双重纯水蒸馏器(上海玻璃仪器一厂);ZD－600电热恒温水浴箱(杭州蓝天化验仪器厂);BX5l光学显微镜和IPP5.1图像分析系统(日本Olympus公司);FA型电子天平(上海台之衡电子衡器有限公司);E60冰冻切片机(英国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组 将动物随机分为空白组，假手术组，模型组、PDTC+模型组、补阳还五汤+模型组，米诺环素+模型组，共6组。每组30只，给予不同处理。

1.2.2 模型建立 参照Longa报道［2］的方法，采用大鼠大脑中动脉线栓法(MCAO)复制局灶性脑缺血模型。术后动物自由饮水、进食。动物于清醒后2h参照文献［3］进行神经功能评分，分值在1～3分者入组，死亡等原因剔除的动物随机替补。假手术组仅作皮肤切开及血管剥离后随即缝合，不做栓线处理。

1.2.3 给药 动物术后开始给药，补阳还五汤，米诺环素均按成人与动物体表面积折算，补阳还五汤大鼠以体质量 250g计算为 5g/(kg·d)，米诺环素为2.35g/(kg·d)，加蒸馏水按相同的灌胃体积配制各浓度药液，每日灌胃1次。模型组和假手术组动物均给予等体积蒸馏水。PDTC按100mg/(kg·d)确定给药量，腹腔注射。

1.2.4 指标检测

1.2.4.1 神经功能评分 参照文献［3］5级评分方法进行评分。无神经损伤症状，0分;不能完全伸展对侧前爪，1分;向瘫痪侧转圈，2分;向对侧倾倒，3分;不能自发行走，意识丧失，4分。各组动物在处死前2h进行评分。

1.2.4.2 免疫组化检测 手术后7、14、21天处死大鼠，10%水合氯醛麻醉后，灌注取脑，然后放入蔗糖溶液中进行梯度脱水，运用单标酶学免疫组织化学法检测NF－κB/P50表达。将染好的切片在显微镜下观察并拍照。每张切片随机选取6个高倍镜视野(×400)，分别计数各视野的阳性细胞数，并取其均值作为每组样本的阳性细胞数。

1.2.5 统计学处理 统计分析应用SPSS 16.0统计软件，所有数据均采用均数±标准差(s)表示。多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者采用LSD法检验，方差不齐用Dunnet’s T3法检验，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补阳还五汤对MCAO模型大鼠神经功能评分的影响 假手术组无明显神经功能缺损症状。经过造模后模型组、各用药组共死亡30只，同时随机替补。用药7天、14天、21天后，模型组的神经功能评分较假手术组显著增加(P＜0.01)。补阳还五汤组、米诺环素组、PDTC组神经功能评分与模型组比较明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，但其组间比较，差异不具有统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 补阳还五汤对MCAO大鼠神经功能症状评分的影响(s，n=10)

表1 补阳还五汤对MCAO大鼠神经功能症状评分的影响(s，n=10)

注:与模型组比较，#P ＜0.05，▲P ＜0.01。

组别 7天 14天 21天0.00 ±0.00假手术组 0.00 ±0.00▲模型组 1.33 ±0.21 1.13 ±0.13 1.25 ±0.16补阳还五汤组 0.50 ±0.22# 0.63 ±0.18# 0.50 ±0.19▲米诺环素组 0.67±0.33# 0.50±0.19▲ 0.63±0.18▲PDTC 组 0.67 ±0.21# 0.63 ±0.18# 0.71 ±0.18正常组#

2.2 补阳还五汤对MCAO大鼠脑组织NF－κB/p50表达的影响

免疫组化结果显示，NF－κB/p50蛋白在细胞核、胞浆内均有表达，表达部位染色呈现棕红色，细胞核为圆形或椭圆形。正常组与假手术组可见少量NF－κB/p50阳性细胞表达，阳性细胞于各脑区散在分布。脑缺血后即可见NF－κB/p50蛋白阳性细胞大量增加，主要集中在梗死周围区、海马回区或皮质，密集分布。补阳还五汤组、米诺环素组、PDTC组7天、14天、21天各时间点阳性细胞数依次减少，与模型组比较也均有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);7天、14天各用药组间比较，差异不具有统计学意义(P＞0.05);而21天组，补阳还五汤组与PDTC组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2、图1。

表2 补阳还五汤对MCAO大鼠脑组织NF－κB/p50阳性细胞数的影响(s，n=6)

表2 补阳还五汤对MCAO大鼠脑组织NF－κB/p50阳性细胞数的影响(s，n=6)

注:与模型组比较，#P＜0.05，▲P＜0.01;与补阳还五汤组比较，☆P ＜0.05。

组别 7天 14天 21天正常组 36.17 ±5.83▲ 33.83 ±5.43▲ 40.50 ±4.11▲假手术组 34.33±7.34▲ 42.67±6.98▲ 37.50±4.98▲模型组 271.83 ±27.62 234.00 ±17.99 128.67 ±10.46补阳还五汤组 145.00 ±13.14# 71.33 ±10.53▲ 35.83 ±7.10▲米诺环素组 128.83 ±6.95# 70.67 ±9.64▲ 43.83 ±7.06▲PDTC 组 132.50 ±9.76# 69.17 ±6.85▲ 57.00 ±2.96▲☆

3 讨论

根据ICVD的临床症状，可将其归属于中医学“中风”的范畴。补阳还五汤主要治疗气虚血瘀型中风，关于其能促进脑梗死患者的神经功能康复临床报道亦不少见［4］。实验研究方面证实，其能通过多种途径对抗 ICVD 的不良损伤［5］，本课题组前期研究［6－8］也证实，补阳还五汤能促进缺血脑组织的神经干细胞的增殖，大脑海马区增殖明显，还可通过影响脑缺血后移植神经干细胞的存活及分化，从而加快脑缺血后神经功能的恢复。近些年，脑缺血后大脑炎症反应的研究受到重视，补阳还五汤在脑缺血后炎症反应方面的作用机制研究逐渐受到关注，且其抗炎效果显著，有待进一步揭示。

图1 补阳还五汤对14天MCAO大鼠脑组织NF－κB/p50免疫组织化学染色结果(×400)

NF－κB［9］是 Rel蛋白家族中的一组重要的核内转录因子，研究发现其在细胞炎症反应、细胞凋亡等病理过程中发挥着重要的作用［1］。它主要以Rel家族蛋白亚基组成的同源或异源性二聚体的形式存在，目前最多的就是由多肽链p50和p65形成的异源性二聚体。Blondeau等研究表明，局灶性脑缺血模型动物经过缺血预处理后，可诱导缺血耐受，表现出NF－κB表达受到抑制，大脑缺血梗死灶体积缩小，从而减轻了神经功能缺损［10］。NF－κB通路与脑缺血后炎症反应的关系密切，报道越来越多，研究也越来越具体，针对脑缺血损伤后炎症反应的NF－κB信号通路的研究也成为目前开发治疗ICVD新药的研究靶点。本实验将NF－κB信号通路中的NF－κB/p50因子作为研究对象深入揭示补阳还五汤治疗脑缺血的作用机制。

研究结果显示，补阳还五汤组、米诺环素组、PDTC组7天、14天、21天各时间点的神经功能评分均较模型组明显减小，而其组间差异不具有统计学意义。上述用药组各时间点NF－κB/p50阳性细胞数减少，与模型组比较均有统计学差异，且补阳还五汤21天组与PDTC组比较差异亦有统计学意义。以上结果说明，补阳还五汤可能通过调节NF－κBp/50蛋白表达，从而达到减轻神经细胞缺血性损伤而起到脑保护作用。由此推测，补阳还五汤和米诺环素，PDTC一样能通过调节NF－κB信号通路来抑制脑缺血损伤的炎症反应，改善神经功能。

［1］Antony P，Petro JB，Carlesso G，et al.B cell receptor directs the activation of NFAT and NF－kappaB via distinct molecular mechanisms［J］.Expcell Res，2003，291(1):11 －24.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91.

［3］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472 －476.

［4］李书霖，李岩，刘慧.李延教授运用补阳还五汤治验举隅［J］.中医药学报，2012，40(1):106 －107.

［5］徐晶，辛随成，张青川.补阳还五汤治疗缺血性脑血管病的研究进展［J］.山西中医学院学报，2009，10(4):73 －76.

［6］蔡光先，刘柏炎.补阳还五汤对体外低糖低氧损伤海马干神经增殖的影响［J］.湖南中医学院学报，2005，25(2):1 －3.

［7］刘柏炎，蔡光先.补阳还五汤对低糖低氧损伤神经干细胞移分化的影响［J］.中国药物与临床，2005，5(3):171 －173.

［8］刘柏炎，蔡光先，陈雪梅，等.补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后神经再生的影响［J］.中华神经医学杂志，2007，6(8):762 －765.

［9］薛剑，周忠光，姜波，等.补阳还五汤对 AD大鼠海马区 NF－κBp65mRNA基因表达的影响［J］.中医药学报，2014，42(3):36－38.

［10］Blondeau N，Widmann C，Lazdunski M，et al.Activation of the nuclear factor － kappaB is a key event in brain tolerance［J］.J Neurosci，2001，21(13):4668 －4677.