蓝萼香茶菜二萜类物质的提取工艺及其急毒实验的研究

张冰月，郎轶咏，王强

(1.北京大学香港科技大学医学中心，广东 深圳 518000;2.解放军第二0二医院，辽宁 沈阳 110000)

蓝萼甲素(glaucocalyxin A)是从唇科香茶菜属植物香茶菜中提取分离出的一个二萜化合物。蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物［1］，生于山谷、林下、草丛中，分布于东北及河北、山西、山东等地。又名回菜花、香茶菜、山苏子、野苏子等，其全草或叶入药能健胃消食，清热解毒，活血［2］，主治脘腹胀痛，食滞纳呆，胁痛，黄疸，感冒发热，乳痈，蛇虫咬伤等［3］。蓝萼香茶菜在我国资源丰富，近几年又发现新的二萜类、三萜类、黄酮及其他化学成分，其中有些成分现有研究已明确具有药理活性［4］。二萜类化合物具有明显的保护心肌细胞以及抗血小板聚集作用［5－7］。血小板具有黏附、聚集和释放等功能，这与血小板具有止血和凝血作用有关。正常的血小板活化是体内生理性止血的必需步骤，而病理性血小板活化与血栓性疾病相关。研究显示，患有栓塞性心脑系统疾病(如冠心病、心绞痛、心肌梗死)的诸多患者，其体循环中的血小板对ADP、AA诱导的聚集性显著增高［8－9］。因此，抑制血小板聚集的异常发生，对于血栓栓塞性心脑血管疾病的预防和治疗具有积极的意义。本实验以冬凌草甲素为对照品，采用紫外分光光度计测定不同提取工艺提取的蓝萼香茶菜总二萜的含量;采用RP－HPLC法测定不同提取工艺蓝萼香茶菜中蓝萼甲素含量;通过花生四烯酸(AA)和ADP诱导的血小板聚集试验测定蓝萼甲素对家兔体外血小板聚集的作用，考察蓝萼香茶菜中总二萜类物质抗凝血作用，为开发新型心脑血管药物奠定基础。

1 材料和仪器

1.1 药品

蓝萼香茶菜(2010年9月采自抚顺新宾地区，由沈阳市解放军202医院制剂室制备);95%乙醇(批号20120114，沈阳鑫金驰商贸责任有限公司);蒸馏水(解放军202医院制剂室提供);甲醇(批号20111208，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);丙酮(批号T20110110，分析纯，国药集团化学试剂有限公司);活性炭粉状(批号20100622，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);蓝萼甲素(纯度≥98%，HPLC，沈阳市解放军202医院制剂室提供，动物体外实验用DMSO助溶);蒸馏水(解放军202医院制剂室提供);花生四烯酸试剂及ADP试剂(美国Sigma公司)。

1.2 动物

昆明种小鼠，体质量20g左右，雄性40只。由沈阳市双义动物研究所提供，动物合格证号:SCXK(辽):2010－001。试验期间由解放军二0二医院动物实验中心提供无菌固体饲料，自由饮水。

1.3 仪器

EYELA旋转蒸发仪(日本东京理化株式会社);EYELA循环水式多用真空泵(日本东京理化株式会社);EYELA水浴锅(日本东京理化株式会社);Lab Tech H35冷凝器(美国Lab Tech公司);FA2004型电子天平，(上海天平仪器厂);电子万用炉(北京市光明医疗仪器厂);电热恒温培养干燥两用箱(厦门医疗电子仪器厂)。

2 实验方法

2.1 蓝萼香茶菜总二萜提取

2.1.1 加热回流法1

取蓝萼香茶菜地上部分，精密称取该植物干叶，搓碎后置于圆底烧瓶中，加8～10倍的95%乙醇没过药材，80℃加热回流提取三次，提取时间分别为8h、6h、6h，过滤、合并滤液，减压浓缩制得稠浸膏1。用甲醇溶解稠浸膏1并进行过滤，滤液加1/100活性炭脱色，并对甲醇进行回收，使之浓缩，形成稠浸膏2，再加丙酮溶解并进行过滤，取滤液浓缩成稠浸膏3，如图1a所示。将所得稠浸膏全部放入干燥箱内干燥粉碎，备用。

2.1.2 加热回流法2

初始过程如2.2.1法操作，得稠浸膏2后，将过滤过程中的滤渣加乙酸乙酯溶解，经过滤纸过滤，回收乙酸乙酯，加热浓缩成稠浸膏3;这一过程中会留下不溶的滤渣，对这些滤渣用甲醇进行溶解，回收甲醇并浓缩，形成稠浸膏4;如图1b所示，将所得稠浸膏全部放入干燥箱内干燥粉碎，备用。

2.1.3 冷浸法

取蓝萼香茶菜全草，精密称取该植物干叶置密封的容器中，加入8～10倍量体积分数95%乙醇冷浸。共浸泡7天，其间每隔半天搅拌1次，使有效成分溶解到溶液中，过滤，取滤液;药渣压榨，再将滤液与榨出液合并，静置5日后滤出药液;对药渣进行再次压榨，并合并浸出液与榨出液，静置3日后，对合并的液体再进行过滤，对所得滤液进行减压浓缩，制得稠浸膏。用甲醇溶解稠浸膏并过滤，对滤液按1/100活性炭进行脱色，回收甲醇使之浓缩成稠浸膏，再加丙酮使之溶解，滤过，取滤液浓缩成稠浸膏;过滤过程中的滤渣全部留下，加乙酸乙酯溶解，过滤，然后回收乙酸乙酯的同时使液体浓缩成稠浸膏;不溶的滤过的滤渣添加甲醇溶解为液体，继续回收甲醇再使之浓缩成稠浸膏;将所得稠浸膏全部放入干燥箱内干燥粉碎，备用。如图1c。

2.2 蓝萼香茶菜总二萜含量的测定

2.2.1 对照品溶液的配制

精密称取冬凌草甲素标准品3mg，置10mL容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制及测定方法

分别精密称取不同方法所制得的蓝萼香茶菜提取物置10mL容量瓶中，加95%乙醇溶液并定容至刻度，再分别精密量取1mL于50mL容量瓶中，加95%乙醇溶液定容至刻度，即得不同方法制得的蓝萼香茶菜提取物供试液。以95%乙醇为空白溶媒，于238nm波长下测定各组吸光度值，代入标准曲线方程计算提取物中总二萜含量。

2.2.3 标准曲线的绘制

化学研究表明，最具有活性成分的二萜和三萜成分均可以以在蓝萼香茶菜茎叶部分中提取到，而二萜类最重要的成分是蓝萼甲素，它的化学式相似于冬凌草甲素，故在使用紫外－分光光度法测定其有效物质含量时，可以冬凌草甲素为标准品，其最大吸收波长在238nm 处。分别精密量取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5mL 于 10mL 容量瓶中，以 95%乙醇稀释至刻度，得系列浓度的溶液。以95%乙醇为空白溶媒，在238nm波长下测定各系列浓度对照品的吸光度A，根据吸光度A绘制标准曲线。

图1 蓝萼香茶菜总二萜提取流程图

2.3 急性毒性实验

取18～22g健康小鼠40只，随机分为4组，雌雄各半，实验前12h禁食不禁水。根据蓝萼香茶菜灌胃给药(药液浓度最高为0.01g/ml)。根据预试结果，确定一次灌胃给药最高剂量为0.002g/kg，最低剂量为0.00025g/kg，剂量比 1∶0.5。灌胃容积 0.2ml/10g，给药后，记录动物死亡及反应情况，连续观察7天。

2.4 统计学处理

采用SPSS 17.0对实验数据进行用SPSS曲线估计模型拟合，P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 标准曲线绘制

以横坐标为浓度(C)，纵坐标为吸光度(A)，如图2。标准曲线测定结果(见图2)表明该标准品在3～45mg/L浓度范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系，线性回归方程为 A=0.0275C－0.0106(R2=0.9994)。

图2 吸光度A与浓度C的标准曲线

3.2 提取工艺对蓝萼香茶菜干燥品中总二萜含量的影响

结合稀释浓度、干燥品总二萜重量、所用的生药重量，计算得出蓝萼香茶菜干燥品中被95%乙醇所提取的二萜类物质百分含量以及每克原药材重所含总二萜含量，结果如表1。

表1 不同提取工艺制得蓝萼香茶菜干燥品中有效成份含量的分析

3.3 急性毒性实验结果

用简化机率法计算LD50及LD50的95%平均可信区间。结果表明，LD50=1.090mg/kg，LD50的95%平均可信限 L95=0.001490 ～0.0007978(见表2)。

表2 蓝萼香茶菜对小鼠灌胃给药LD50实验结果(n=10)

4 讨论

最佳的提取工艺对药物的分子量、溶解度、化学稳定性、提取量等都有一定的影响，本实验最开始对三种最佳提取工艺进行了研究。考虑到各溶剂的提取效率、毒性、成本、提取量等因素，在蓝萼香茶菜急性毒实验的提取工艺中，使用95%乙醇为溶剂。

三种方法提取蓝萼香茶菜茎叶部分生药中总二萜含量最高的是第二种，第一种其次，但是综合考虑各方法的提取效率、毒性、成本、灌胃性状等因素，建议在蓝萼香茶菜动物实验中，使用第一种方法提出的蓝萼香茶菜总二萜。

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