miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌 细胞生物学行为的影响

林孟波，王金泗，薛芳沁，黄若磊，李伟华

论著·基础

miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌 细胞生物学行为的影响

林孟波，王金泗，薛芳沁，黄若磊，李伟华

目的探讨MicroRNA-126(miR-126)在人结肠癌细胞中的表达以及对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法应用荧光PCR定量检测60例结肠癌患者的结肠癌组织以及癌旁组织中miR-126的表达，共60对，再测定5株结肠癌细胞(SW480、HT29、HCT116、LOVO、SW620)中的表达情况;CCK-8法、划痕实验和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并进一步通过体外实验研究miR-126对结肠癌细胞生物学行为的影响。结果与癌旁组织细胞比较，miR-126在结肠癌细胞中表达下降(95.0% vs.55.0%，P<0.05)，发生转移者与未发生转移者比较，差异有统计学意义(25.0% vs. 75.0%，P<0.05)。miR-126可以抑制SW480细胞的生长及其侵袭转移，有基质胶Transwell实验中，转染组及空白对照组细胞迁移数分别为(10.0±4.3)个和(258.0±30.6)个；无基质胶的Transwell实验中，分别为(84.0±13.2)个和(335.0±27.3)个，差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-126高表达可以增强癌细胞对奥沙利铂的敏感性。结论miR-126可明显抑制结肠癌细胞的发生发展，影响多种结肠癌细胞株生物学行为。

miR-126；结肠癌细胞；生物学行为；影响

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，好发于直肠乙状结肠交界处，近年来发病率逐年上升，2012年《肿瘤登记年报》排名第3位，发病率为29.44/万，病死率排第5位，为14.23/万。结肠癌组织学主要为腺癌、黏液腺癌和未分化癌，危害极大[1]。最近的研究表明miR-126在肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达均下降，但其在结肠癌中表达是否下降仍然不很清楚，其在结肠癌发生发展中的分子机制也不甚了解。现通过基因表达芯片技术了解miR-126在结肠癌组织、癌旁组织和5株人结肠癌细胞系中的表达及变化，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2013年1—9月我院肿瘤科确诊为结肠癌手术患者的肿瘤组织和癌旁组织(癌旁0.5 cm和癌旁15 cm)，共60例，患者在手术前均未进行放、化疗。男40例，女20例，年龄35～65(50.0±1.6)岁。组织学类型：高分化13例，中分化17例，低分化30例。Dukes分期：A期4例，B期23例，C期20例，D期13例。有淋巴结转移36例，无淋巴结转移24例。有远处转移13例，无远处转移47例，所有组织于离体15 min内置于液氮罐中保存。

1.2 细胞系、载体及试剂 5株人结肠癌细胞系SW480、HT29、HCT116、LOVO 和 SW620 均购买于行知生物科技有限公司，HEK293T细胞株购自美国ATCC(美国模式菌种收集中心)。慢病毒表达载体pGIPZ、慢病毒包装质粒pCD/NL-BHDDD、膜蛋白表达质粒pLTRG均购自深圳市宝珠生物科技有限公司。Lipofectamine2000购自上海叶舟生物科技有限公司，快速限制性内切酶CLaI、MLuI、T4DNA连接酶均购自美国Fermentas公司,CCK-8试剂盒、DMEM培养液、地高辛标记hsa-miR-126寡核苷酸探针购自丹麦Exiqon公司。胎牛血清购自上海拜力生物科技有限公司，总RNA的提取液，IRS-l兔单克隆抗体购自Epitomics公司。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞培养：将5种结肠癌细胞株(SW480、HT29、HCT116、LOVO、SW620)，在含有100 ml/L胎牛血清的1640培养基和DMEM培养液中(37℃ 5% CO2饱和湿度)常规培养，这些细胞株代表的组织各异，分别用来检测miR-126在各自细胞株的表达，在细胞生长状态良好时(取对数生长期)用于实验[3]。SW480主要用于测定细胞的侵袭转移对细胞生长的影响；SW620用于细胞转染。分别测定miR-126在各个细胞的表达。

1.3.2 RT-PCR检测miR-126在结肠癌组织及癌旁细胞中的表达：利用总RNA的提取液，严格按照提取液操作说明书提取结肠癌组织和癌旁细胞中总RNA ，CDNA的制备按照All-in-one miRNA qRT-PCR Detection kits，反应体系如下：RNA 2 μg，poly A polymerase(2.5 U/μl,1 μl) ,RTase Mix 1 μl,5×Reaction Buffer 5 μl,加H2O至终体积25 ml。反应条件:37.5℃ 90 min,80℃ 5 min,25℃保存。实施定量的反应体系同样用All-in-one miRNA qRT-PCR Detection kits说明书进行，反应条件：预期变性90℃ 10 min，90℃ 10 s,退火60℃ 30 s。

1.3.3 miR-126慢病毒表达载体构建：利用Primes软件设计引物，同时引入CLaI、MLuI酶切位点及引物的序列及末端的保护碱基，根据生物信息技术从数据库可以查出基因序列为引物序列：5`-CGACGCGTCGGGTTTACAGAACACCCATCA-3`，Reverse:5`-CCATGGGGCACAGCAACAAAAGACT-3`，扩增的片段长度为357 bp,以正常黏膜组织DNA为模,PCR扩增miR-126，在一定的反应条件下，循环扩增。将扩增的产物利用琼脂浆电泳液电泳，如果发现无杂带就直接对PCR产物纯化回收。经CLaI、MLuI酶切PCR产物，连接到pGIPZ载体上，再经过转化、挑选单克隆、菌液PCR鉴定阳性菌落制备小量的质粒，通过酶切，测序后得到正确的重组质粒pGIPZ-miR-126。

1.3.4 结肠癌细胞的复制能力：按照CCK-8试剂盒说明进行。将细胞按每孔2×103/150 μl接种于100孔板中继续培养,每组设3个复孔,分别选取1、3、5、7 d时间点进行检测,检测前换液1次,每孔加100 μl新鲜培养基和10 μ1 CCK-8,继续在37℃ 5% CO2条件下培养2 h,使用酶标仪于550 nm波长检测光密度值。

1.3.5 划痕实验：细胞铺入8孔板,放入37℃ 5% CO2培养箱中孵育，等到细胞融合达85%以上时,用15 μl微量移液头在8孔板内水平划痕,PBS液洗涤3次，每隔24 h在倒置显微镜下观察细胞的迁移情况并拍照[4]。

1.3.6 细胞转染：转染前1天，将对数生长期的HCT116细胞接种于8孔培养板。每孔2×105个细胞。24 h培养至细胞融合度 60%时，分为pGIPZ-miR-126转染组、空白对照组(pGIPZ)。按照Lipofectamine2000说明书，将2组病毒上清分别感染SW480细胞，感染后72 h荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的发光情况，成功转染细胞后置于37℃5%CO2的培养箱中培养[5]。

1.4 统计学方法 利用SPSS13.0软件进行数据处理。组织标本采用配对样本t检验比较miR-126水平差异,荧光定量PCR采用单因素方差分析，体外增殖实验采用析因设计的方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-126在结肠癌组织中表达 应用Real-timePCR检测60对配对的结肠癌组织中miR-126的表达，结果显示，癌旁组织中miR-126阳性率为95.0%，明显高于结肠癌组织的55.0%(P<0.01)。见表1。进一步分析miR-126与结肠癌临床特点的关系表明，miR-126表达与性别、年龄、癌组织分化程度以及肿块大小均无明显的相关性(P>0.05),而无转移的结肠癌细胞中miR-126的阳性表达率为75.0%，高于已发生侵袭转移者的25.0%(P<0.05)。见表2。

表1 结肠癌组织和癌旁组织中miR-126的表达 [n(%)]

注：与癌旁组织比较,*P<0.01

表2 miR-126表达与结肠癌临床特点相关性分析

2.2 miR-126表达对结肠癌细胞生物学行为影响

2.2.1 miR-126表达可抑制SW480细胞生长：利用MTT比色法检测转染组和空白对照组SW480细胞的增殖能力，结果显示随培养时间的延长，转染组细胞增殖能力明显低于空白对照组，提示miR-126具有抑制结肠癌细胞增殖的能力。进一步对2组细胞周期进行检测发现，miR-126主要阻滞肠癌细胞G1期进程。

2.2.2 miR-126抑制SW480细胞侵袭转移：利用有基质胶及无基质胶Transwell实验检测miR-126对细胞迁移、侵袭能力的作用，经过一段时间的观察，结果表明，有基质胶的细胞培养36 h后，转染组及空白对照组细胞迁移数分别为(10.0±4.3)个和(258.0±30.6)个;无基质胶的细胞在培养36 h后计数,转染组和空白对照组分别为(84.0±13.2)个、(335.0±27.3)个，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.3 miR-126的表达对结肠癌细胞耐药性的影响：使用奥沙利铂(抗癌类药物)处理细胞，发现转染组SW480细胞对奥沙利铂的敏感性明显高于空白对照组(P<0.05)。说明结肠癌细胞中恢复miR-126的表达可提高癌细胞对化疗类药物的敏感性。通过增加miR-126可以加强化疗类药物的药效，进一步可以加强对结肠癌的治疗。

3 讨 论

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，结肠癌发病与高脂肪食物和纤维素摄入不足有关。结肠的慢性炎性反应使肠癌的发生率比一般人群高。有结肠息肉者结肠癌发病率是无结肠息肉者的5倍[5]。家族性多发性肠息肉病，癌变的发生率更高。遗传因素可能也参与结肠癌的发生。其发病率和病死率在世界大多数国家及地区有上升趋势，给人类的健康带来严重的危害，发生侵袭转移为其主要死因。MicroRNA(miRNA)是近年新发现的一类非编码小分子单链RNA，长度为21～23个核苷酸。在细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤的发生发展等方面具有重要的生物学功能。miR-126参与调节血管生成和维持血管完整性。

miR-126在肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中表达都会下降，在结肠癌细胞株中特别是高侵袭转移能力的细胞系中表达下调，尤其是发生侵袭转移的癌组织中表达降低，高度提示miR-126在结直肠癌侵袭转移中发挥重要作用[6]。Guo等[7]研究表明miR-126在结肠癌细胞中普遍缺失。本研究表明在结肠癌组织存在miR-126表达下降，并且miR-126表达水平的变化与结肠癌是否发生侵袭转移密切相关(P<0.05)，与文献报道相近。体外实验还证实miR-126可通过抑制结肠癌细胞周期(主要为G1期)进程、促进结肠癌细胞凋亡而发挥抑瘤作用，并可显著抑制结肠癌细胞迁移及侵袭能力[8]。但是对于miR-126表达方式以及miR-126对结肠癌细胞作用的具体分子机制现在还不甚了解，有待于进一步研究。

本研究表明高表达miR-126的细胞株对转移性结肠癌一线化疗药物奥沙利铂的敏感性明显高于空白对照组，可见在结肠癌细胞中恢复miR-126的表达可抑制结肠癌细胞增殖、侵袭转移并减少耐药性的发生，同时也表明增加miR-126的表达可以进一步增加化疗药物的疗效。与前期的研究报道相符。化疗过程中可以按照周期进行，同时应用使miR-126恢复的药物治疗方法可以使治疗效果更好。

加强对结肠癌发生发展的预防，慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。每年要定期在结肠癌高危人群中进行筛检，通过检测miR-126表达的变化防止癌细胞发生转移[9～11]。最好能早发现、早诊断、早治疗，降低疾病的病死率。对已经确诊的结肠癌患者最好检测miR-126表达的变化，指导预后判断，miR-126表达水平越低患者预后越差。

1 李楠,李夏雨,黄铄,等.miR-126靶向调控IRSl，SLC7A5及TOM l基因抑制结肠癌的增殖及侵袭转移[J].中南大学学报，2013,38(8)：809-811.

2 陈芳,周畅,陆艳霞,等.Hsa-miR-186在结肠癌细胞中的表达及作用[J].南方医科大学学报,2013,33(5):654-660.3 张文鹏,赵红超,赵敬坤,等.miR-301a在结肠直肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞侵袭[J].外科理论与实践，2013,18(3)：236-241.4 史留斌,宋宁,王燕,等.真核翻译起始因子-3c在结肠癌细胞中的表达及其对细胞增殖的影响[J].中国临床医学，2013,20(4)：480-483.

5 章福彬,朱斌,唐郡,等.siRNA沉默Musashi-1基因表达对人HCT116结肠癌细胞生物学行为的影响[J].局部手术学杂志，2013,21(6)：604-606.

6 陈卫群,陈和明,孔德勇,等. microRNA-301在胰腺癌中的表达及其临床意义[J]. 中华检验医学杂志,2010,33(1):62-67.

7 Guo C，Sah JF.The noncoding RNA，miR-126，suppresseSthe growth of neoplastic cellSby targeting phosphatidylinositol 3-kinase singaling and iSfrequently lost in colon cancres[J]. GeneSChromosomeSCancer，2008，47(11)：939.

8 杨爱萍,姜藻,陈静.Musashi-1、Ki-67 的表达与食管鳞癌的临床意义[J].中国现代医生，2009，47(32):58-60.

9 Din FV,Theodoratou E,Farrington SM,et al.Effect of aspirin andNSAIDSon risk and survival from colorectal cancer[J].Gut，2010,59(12)：1670-1679．

10 苏沐,姜藻.5-FU对SW480细胞Musashi-1基因表达的影响[J].东南大学学报：医学版,2007，26 (3):198-201．

11 叶任高,陆再英.内科学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2005:340-346.

miR-126expressionanditseffectonhumancoloncancercellsinthebiologicalbehaviorofcoloncancercells

LINMengbo,WAGNJinsi,XUEFangqin,HUANGRuolei,LIWeihua.

DepartmentofOncology,FujianProvincialHospital,Fuzhou350001,China

ObjectiveTo investigate the expression of MicroRNA -126 (miR-126) in human colon cancer cellSand itSeffect on biological behavior of colon cancer cells.MethodsSixty patientSwith colon cancer were enrolled in the study. Fluorescence PCR waSused to detect the expression of miR-126 in the cancerouStissueSand in the tissueSadjacent to carcinoma. The expression of miR-126 in the cancerouStissueSpaired up with the expression of miR-126 in the tissueSadjacent to carcinoma,and there were 60 pairSin total. The expression of miR-126 in 5 colon cancer cell lineS(SW480,HT29,HCT116,LOVO,SW620) waSalso detected. The proliferation,migration and invasion ability of the cellSwere measured using CCK 8 assay,scratch experimentSand Transwell assay,respectively. The effect of miR-126 on the biological behaviorSof human colon cancer cellSwaSfurther studied through the experimentSin vitro.ResultsCompared with adjacent normal tissue cells,miR-126 waSdecreased (95.0% vs. 55.0%,P<0.05) in colon cancer cells,and were obviously when cancer metastasiSor invasion iSparticularly evident,when compared with those without metasis,there were significant difference(25.0% vs.75.0%,P<0.05). StudieShave shown that miR-126 can inhibit the growth of SW480 cellSand their invasion and metastasis,Transwell assay with matrigel showed the migration cell number in transfection group and blank control group waS(10.0±4.3) and (258.0±30.6),while Transwell assay without matrigel showed the migration cell number waS(84.0±13.2) and (335.0±27.3) respectively,there were significant differences(P<0.05). miR-126 expression can enhance the sensitivity of cancer cellSto oxaliplatin.ConclusionmiR-126 can inhibit the development of colon cancer cells,the impact of a variety of strainSof the biological behavior of colon cancer cells.

Micro RNA-126;Colon cancer cells; Biological behavior; Impact

350001 福州，福建省立医院肿瘤外科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.021

2013-11-15)