鸡冠花褐斑病病原菌的生物学特性研究

刘起丽，张建新，田雪亮，郎剑锋

(1.河南科技学院资源与环境学院，新乡 453003；2.中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193；3.河南师范大学生命科学学院，新乡 453007)

鸡冠花褐斑病病原菌的生物学特性研究

刘起丽1, 2，张建新3，田雪亮1，郎剑锋1

(1.河南科技学院资源与环境学院，新乡 453003；2.中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193；3.河南师范大学生命科学学院，新乡 453007)

鸡冠花(CelosiacristataLinn.)是一种广泛种植的观赏和药用花卉。鸡冠花褐斑病是危害鸡冠花生产的主要病害，本研究对分离自河南北部地区花圃的鸡冠花褐斑病病原菌硫色镰孢菌(Fusariumsulphureum)进行了鉴定和生物学特性研究。菌落在添加了鸡冠花叶片汁液的燕麦粉琼脂培养基上生长较好，生长最适温度为25 ℃。病原菌分生孢子萌发最适温度为20 ℃；酸性环境最有利于分生孢子萌发。分生孢子在5%蔗糖溶液中的萌发率与在5%葡萄糖溶液中相近且均高于清水和蒸馏水中的萌发率，光照条件对其萌发影响不大。

鸡冠花褐斑病； 病原菌； 生物学特性

鸡冠花(CelosiacristataLinn.)是苋科一年生草本植物，其茎叶、花序和种子均可药用[1-2]，其干燥花序为止血止带的中药材，被《中国药典》收录[3]。鸡冠花褐斑病(brown spot of cockscomb)是危害鸡冠花的一种常见真菌病害，全国各地均有发生。近几年在豫北地区温室及花圃发生尤为普遍和严重。该病病原菌属半知菌亚门硫色镰孢菌(FusariumsulphureumSchltdl.)和鸡冠花砖红镰孢菌(F.lateritiumf.sp.celosiaeTassi)，叶片初生淡黄褐色小点，后扩大成近圆形或椭圆形，直径1～10 mm,边缘暗褐色至紫褐色，略隆起，具模糊的同心轮纹，发展后期常造成叶片变褐枯黄、茎部腐烂倒伏、根部腐烂表面布满白色细丝状物，严重影响其药用价值。本研究对豫北地区鸡冠花褐斑病病原菌进行了分离与鉴定，并对病菌的生物学特性进行了初步研究，旨在为该病害的进一步防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采自豫北地区鸡冠花苗圃内发病的鸡冠花叶片，叶片上有直径1～10 mm的椭圆形具模糊的同心轮纹状坏死斑，病斑边缘褐色至紫褐色。

1.2 病原的分离与鉴定

随机选取带有病斑的鸡冠花病叶，在超净工作台上用75%乙醇擦拭后，在病健交界处划取若干片4 mm2的小块组织放入0.1%升汞中表面消毒约1 min，用无菌水冲洗2～3遍后接种到PDA培养基上，25 ℃培养。待长出菌丝后纯化至新培养基平板上，直到获得纯培养。观察病菌培养性状，光学显微镜下观察并描述其形态特征。

1.3 病菌致病性验证

将经75%乙醇表面消毒的健康鸡冠花叶片，平放在含苯并咪唑60 mg/L的培养基上。在每片叶子上接种2块直径为8 mm的菌块，以不接菌块为对照，25 ℃培养。待发病后取病健交界处叶片组织分离病原菌。

1.4 病菌生物学特性研究

1.4.1 不同培养基对病菌生长的影响

供试培养基[4]有PDA、燕麦粉琼脂培养基(燕麦粉25 g，琼脂17 g，水1 000 mL)、鸡冠花叶片汁液+PDA培养基、鸡冠花叶片汁液+燕麦粉琼脂培养基(鸡冠花叶片20 g，燕麦粉25 g，琼脂17 g，水1 000 mL)、鸡冠花叶片汁液+琼脂培养基(鸡冠花叶片20 g，琼脂17 g，水1 000 mL)。

1.4.2 光照对菌落生长的影响

用打孔器打直径为3 mm的菌饼接于1.2.1筛选出的最佳培养基平板上，置于25 ℃人工气候培养箱内，设定3种光照条件：全光照、全黑暗、半光半暗，每隔2 d测量菌落直径[5]。

1.4.3 温度对菌落生长的影响

接菌于1.2.1筛选出的最佳培养基上，每个平板接3块。设15、20、25、30 ℃共4个温度，每隔2 d测菌落直径[6]。

1.4.4 温度对分生孢子萌发的影响

将病叶在25 ℃保湿培养1 d，待产孢后制成孢子悬浮液(40倍镜下每个视野中含有20～30个孢子)。设15、20、25、30 ℃共4个温度梯度，以悬滴法做孢子萌发试验，每隔2 h镜检1次，各处理观察的孢子总数为300个左右，计算孢子萌发率。

1.4.5 营养对分生孢子萌发的影响

将病叶保湿培养后产生的孢子分别用蒸馏水、自来水、5%葡萄糖、5%蔗糖液配制孢子悬浮液(40倍镜下每个视野中含有20～30个孢子)做孢子萌发试验，12 h后观察并计算孢子萌发率，各处理观察的孢子总数为300个左右。

1.4.6 pH对分生孢子萌发的影响

用Na2HPO4、KH2PO4和柠檬酸配制pH为2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的缓冲溶液，用悬滴法25 ℃培养分生孢子，12 h后镜检孢子萌发率，各处理观察孢子总数为300个左右。

1.4.7 光照对分生孢子萌发的影响

用悬滴法将孢子悬浮液(40倍镜下每个视野中含有20～30个孢子)在25 ℃下培养，设定全光照、全黑暗、半光半暗3个处理，24 h后镜检孢子萌发率，各处理观察的孢子总数为300个左右。

2 结果与分析

2.1 病菌特征描述

培养基上菌丝初为白色、絮状，后期形成大量肉粉色至橙色孢子堆，光学显微镜下主要发现其大型分生孢子。分生孢子纺锤形、弯曲，具有明显的背腹面、顶端和足细胞，成熟时具1～6个分隔(图1)，成熟后分生孢子平均大小约为61.7 μm×7.3 μm；分生孢子梗上的瓶状小梗平均大小约为18.98 μm×4.65 μm(图1)；结合其菌落特征，根据Booth镰刀菌分类系统[7]，鉴定该菌为硫色镰刀菌(Fusariumsulphureum)。

图1 病原菌形态Fig.1 Morphology of the pathogen

2.2 病菌致病性测定结果

将病菌回接鸡冠花叶片发病后表现出与原采集病叶相同的症状。从病健交界处能够再次分离得到原接种病菌，培养形状和分生孢子形态与原接种病菌均一致。

2.3 病菌生物学特性

2.3.1 培养基对病菌生长的影响

从表1可以看出，在供试的5种培养基中，菌落的生长以鸡冠花叶片汁液+燕麦粉琼脂培养基最适宜，培养2 d后，菌落直径显著高于其他4个处理；其次是鸡冠花叶片汁液+琼脂培养基；菌丝在单纯的燕麦粉琼脂培养基上生长速度最慢。

表15种培养基对病原菌菌落生长的影响1)

Table1Theeffectsoffivemediaongrowthofthispathogenicfungus

培养基Medium菌落直径平均值/mmAveragecolonydiameter1d2d3dPDA4．6bBC7．4cB8．4cB燕麦粉琼脂培养基Oatmealagarmedium4．1cC6．5dC7．8dC含叶片汁液的PDALeafjuice⁃PDA5．1aAB7．5bcB8．6bcB含叶片汁液的燕麦粉琼脂培养基Leafjuice⁃oatmealagarmedium5．3aA8．5aA9．3aA含叶片汁液的琼脂培养基Leafjuice⁃agarmedium5．3aA7．9bAB8．9bAB

1) 数据后小、大写英文字母分别表示0.05、0.01水平差异显著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.2 光照对菌落生长的影响

从表2可知，在3种光照处理下培养2 d时菌落的生长直径差异不显著，说明生长前期光照对该菌菌落生长影响不大，有无充足的光照该病菌均可生长。随着培养时间增加，半光半暗的条件下最适合该病原菌的菌丝伸长和蔓延。

表2光照对菌落生长的影响1)

Table2Theeffectoflightingonthegrowthofcolony

光照条件Lighting菌落直径/mmColonydiameter2d4d6d8d全光照Lightfor24h8．5aA9．8bB18．3bA15．9bA半光半暗Lightfor12h8．9aA12．6aA20．1aA16．8aA全黑暗Darkfor24h8．6aA10．6bB19．6aA16．2abA

1) 数据后小、大写英文字母分别表示0.05、0.01水平差异显著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.3 温度对菌落生长的影响

由表3可知，该病原菌在15～30 ℃均可以生长，2 d后在25 ℃时生长最快，30 ℃时生长速度稍有下降但与25 ℃时差异不显著。随着培养时间的增加，25 ℃时的菌落生长直径显著高于其他3个处理。在4个温度梯度下，病菌接种2 d后均可观察到明显的菌丝生长与扩散，但整体来看该菌的生长速度并不快。

表3培养温度对菌落生长的影响1)
Table3Theeffectoftemperatureonthegrowthofcolony

温度/℃Temperature菌落直径/mmColonydiameter2d4d6d156．6bB8．0dD10．8cB206．9bB8．9cC11．6cB258．7aA12．8aA19．7aA308．3aA10．6bB18．8bA

1) 数据后小、大写英文字母分别表示0.05、0.01水平差异显著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.4 温度对分生孢子萌发的影响

由表4可见：用悬滴法检测分生孢子萌发率时，鸡冠花褐斑病菌的分生孢子萌发主要集中在前12 h，这段时间中孢子萌发数量较多，12 h之后孢子萌发率增长较慢，在20 ℃时萌发效果最好。温度太高反而抑制了分生孢子的萌发。

表4不同温度下的孢子萌发率1)

Table4Thesporegerminationrateunderdifferenttemperatures

温度/℃Temp⁃erature孢子萌发率/%Sporegerminationrate4h8h12h16h20h24h1541．3cC60．5dD82．4cB89．3cC95．4bA98．6bA2058．7aA80．3aA94．4aA98．6aA99．5aA100．0aA2549．6bB73．2bB89．7bA94．3bAB97．6abA99．2abA3048．5bB65．7cC88．6bA90．1cBC95．4bA98．9abA

1) 数据后小、大写英文字母分别表示0.05、0.01水平差异显著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.5 营养条件对分生孢子萌发的影响

从表5可以看出：在5%蔗糖溶液中分生孢子萌发率相对较高，显著高于其他3个处理，分生孢子在5%葡萄糖溶液中也有较高的萌发率，在自来水中萌发率显著低于其他处理。

表5分生孢子在不同营养液内的萌发率1)

Table5Thegerminationrateoftheconidiaunderdifferentnutrientsolutions

处理Treatment萌发率/%Germinationrate蒸馏水Distilledwater89．1bA自来水Tapwater64．0cB5%葡萄糖溶液5%Glucosesolution90．3bA5%蔗糖溶液5%Sucrosesolution95．0aA

1) 数据后小、大写英文字母分别表示0.05、0.01水平差异显著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.6 pH对分生孢子萌发的影响

从表6可以看出，鸡冠花褐斑病菌的分生孢子在酸性、中性、碱性条件下均能萌发，但在酸性条件下更好，萌发率更高，萌发最适pH在5.0左右。

表6不同pH下分生孢子的萌发率1)

Table6ThegerminationrateoftheconidiaunderdifferentpHvalues

pH萌发率/%Germinationrate2．556．2dC3．081．3cB4．089．7aA5．089．9aA6．085．5bAB7．085．9bAB对照CK(5．5)87．6abA

1) 数据后小、大写英文字母分别表示0.05、0.01水平差异显著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

2.3.7 光照对孢子萌发的影响

由表7可知，3种光照条件下病菌分生孢子萌发率均超过了80%，不同的光照时间对孢子萌发率的影响差异不显著，这表明鸡冠花褐斑病菌的分生孢子萌发受光照时间的影响不大，对光照条件要求不严格。

表7分生孢子在不同光照条件下的萌发率1)

Table7Thegerminationrateoftheconidiaunderdifferentlightingconditions

处理Treatment萌发率/%Germinationrate全光照Lightfor24h84．2aA半光半暗Lightfor12h85．6aA全黑暗Darkfor24h82．7aA

1) 数据后小、大写英文字母分别表示0.05、0.01水平差异显著性。 Different lowercase and uppercase letters in the same column indicate 0.05 and 0.01 significance levels, respectively.

3 讨论

引起鸡冠花褐斑病[8]的硫色镰孢菌在添加了寄主叶片汁液的PDA培养基上生长较快，说明该病菌的生长可能与鸡冠花叶片中的一些成分有关，汁液的存在刺激了病菌的快速生长。该病菌分生孢子能在较广泛的酸度范围内萌发，对营养、温度和光照条件的要求不是特别严格。这与马铃薯干腐病菌硫色镰孢的生物学特性[9]有相似之处。该试验结果为鸡冠花褐斑病的发病率高、传播速度快的特点提供了理论依据。鸡冠花褐斑病严重时叶片黄萎、过早凋落，严重影响光合作用和降低观赏价值，直至影响到植株正常开花和结籽，导致主要药用部分花和籽的产量降低，因此已成为鸡冠花实际生产中影响产量和经济效益的重要制约因素。分生孢子的萌发率高低对鸡冠花褐斑病的发生轻重有重要影响，生产过程中可通过控制环境条件来减轻该病的发生，如：尽量采取浇灌方式，避免喷灌，降低叶表面湿度；遇到连阴雨天气或空气相对湿度较高时，及时喷洒杀菌剂预防等。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海: 上海科技出版社, 1977: 1211-1212.

[2] 李时珍.本草纲目[M].北京: 人民卫生出版社, 1979: 965-966.

[3] 国家药典委员会.中国药典[M].北京: 中国医药科技出版社, 2010: 181.

[4] 方中达.植病研究方法[M].北京: 中国农业出版社, 1998: 46-49.

[5] 陆宁.三七圆斑病病原菌分生孢子的生物学特性[J].中药材, 2005, 28(9):748-750.

[6] 李金花, 柴兆祥, 王蒂.秦艽斑枯病病原菌鉴定及生物学特性研究[J].中药材, 2007, 30(1):3-6.

[7] Booth C.镰刀菌属[M].陈其煐，译.北京: 农业出版社, 1988.

[8] 欧阳秩, 吴邦承.观赏植物病害[M].北京: 中国农业出版社, 1996.

[9] 杨志敏,毕阳,李永才,等.马铃薯干腐病菌硫色镰孢的生物学特性[J].菌物学报, 2012, 31(4): 574-583.

Biologicalcharacteristicsofthepathogenicfungusofbrownspotofcockscomb

Liu Qili1,2,Zhang Jianxin3,Tian Xueliang1,Lang Jianfeng1

(1.SchoolofResources&EnvironmentalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China; 2.CollegeofAgronomyandBiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China; 3.CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,China)

Celosiacristatais a widely cultivated ornamental and medicinal flower.Brown spot of cockscomb is one of the main diseases of cockscomb.In this study, the pathogenic fungus of brown spot of cockscomb from northern Henan Province,Fusariumsulphureum, was identified and its biological characteristics were determined.The clones of the pathogens grew better on the oatmeal agar medium added with leaf juice, and the optimum temperature was 25 ℃.The rate of spore germination was highest at 20 ℃ in acid environment.The rate of conidial germination in 5% sucrose solution was close to that in 5% glucose solution, and both rates were higher than those in tap water and distilled water, and the lighting had no effect on conidial germination.

brown spot of cockscomb; pathogenic fungus; bionomics

2013-05-14

： 2013-07-17

“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD14B08)

S 436.8

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.018

联系方式 E-mail:liuqili2002@163.com