鬼箭羽配伍荔枝核对果蝇模型糖脂代谢的影响

段寅慧,吴 敏,2*

(1.南京中医药大学第一临床医学院,南京 210029;2.南京中医药大学附属医院,南京 210029)

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是由于体内胰岛素分泌绝对或相对不足而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，并有遗传倾向的疾病，其发病机制尚不明确。糖尿病属于中医消渴病范畴。国医大师周仲瑛教授提出“瘀热致消”理论[1]，临床常用鬼箭羽与荔枝核配伍治疗糖尿病及其并发症，取得一定的疗效。本实验采用果蝇作为实验动物模型，探讨鬼箭羽和荔枝核治疗机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Oregon Red果蝇由中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室提供。

1.2 饲料(自配) 正常果蝇食物配方：水1 L，酵母25 g，大豆粉9.18 g，玉米粉67.05 g，蔗糖40 g，麦芽糖42.4 g，琼脂粉6 g，甲酸甲酯/无水乙醇0.25 mL/2.5 mL、苯甲酸钠1 g，丙酸6.875 g。高糖食物配方：上述正常果蝇食物配方中，增加20%蔗糖。高脂食物配方：上述正常果蝇食物配方中，增加20%棕榈酸。

1.3 试剂与设备 鬼箭羽(产地：湖北；批号：121001)、荔枝核(产地：广东；批号：111001)均购于南京中医药大学百草堂中医门诊部；仪器和设备由中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室提供，试剂购于南京凯基生物公司，葡萄糖检测试剂盒、三酰甘油检测试剂盒。

1.4 药物提取方法 鬼箭羽、荔枝核各20 g混合，70%乙醇400 mL，旋转蒸发仪,加热回流提取2 h，2次，50 ℃浓缩至浸膏状态，-80 ℃冷冻，冷冻干燥仪干燥至粉状，密封-20 ℃保存。

1.5 糖尿病果蝇模型的建立 高糖诱导的果蝇糖尿病模型和高脂诱导的果蝇糖尿病模型均设空白对照组、模型组和给药组。将3 d雄性果蝇随机分组,空白对照组的果蝇使用正常的果蝇培养基，将随机挑选出的高糖诱导的果蝇糖尿病模型喂养高糖果蝇培养基1周后,再随机分为模型组和给药组,给药组喂养加入占食物总重量1%的鬼箭羽和荔枝核提取物的高糖饲料1周(高脂诱导的果蝇糖尿病模型高脂造模方法同高糖造模方法)。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 果蝇进食量测定 根据鬼箭羽和荔枝核在临床上的用药剂量,制定给药组果蝇饲料的给药浓度，设定占食物重量0.2%、1%、5%3个浓度，挑选出跟空白对照组相比进食量差别最小的浓度进行下一步实验。

1.6.2 果蝇进食量测定方法 将正常果蝇培养基喂养1周的雄性果蝇,饥饿4 h后，随机分为3个浓度组,0.2%、1%、5%鬼箭羽和荔枝核提取物组，并包含0.8% Blue 9(erioglaucine disodium salt)的正常果蝇食物，进食15 min后，取6只，加入500 μLPBS，高速匀浆后，12 000 r/min离心5 min，吸上清，14 000 r/min离心20 min，取200 μL上清至96孔板，酶标仪分别测定625、675 nm吸光度。

1.6.3 体质量 将果蝇麻醉后，称体质量。

1.6.4 海藻糖浓度测定 果蝇循环体液中主要是海藻糖,测定海藻糖浓度可反映果蝇血糖水平。取4只果蝇，加70%乙醇0.5 mL高速匀浆后，14 000 r/min离心5 min；取上清,45 ℃至真空干燥45 min，冷却至室温，取200 μL的2% Na2SO4溶解，100 ℃加热10 min，至室温，酶标仪测定620 nm吸光度。

1.6.5 三酰甘油浓度测定 取6只果蝇，放入EP管中，置于冰上，加0.5 mL 0.05% TWEEN-20水溶液，高速匀浆。5 000 r/min离心40 min，取上清5 μL，加入100 μL裂解液、800 μL d2H2O,200 μL的不含甘油的试剂(catalog#500-0006),孵育3 min，酶标仪测定595 nm吸光度。

1.6.6 蛋白浓度测定 取1.6.6剩下的400 μL，70 ℃灭活5 min，与10 μL的10 mg/mL Lipoprotein-Lipase 37 ℃12 h裂解液,5 000 r/min离心1 min，取200 μL移置新的EP 管中，14 000 r/min离心3 min，取50 μL上清至free glycerol reagent (Sigma catalog#F6428)37 ℃中孵育30 min，酶标仪测定540 nm吸光度。

2 结果

2.1 鬼箭羽配伍荔枝核对高糖诱导的果蝇糖尿病模型海藻糖浓度、三酰甘油浓度、蛋白浓度的影响 模型组与空白对照组相比海藻糖浓度明显升高，有显著统计学意义(P<0.01);三酰甘油浓度明显升高，有统计学意义(P<0.05)；蛋白浓度无显著差别(P>0.05)，差异无统计学意义。给药组与模型组相比海藻糖浓度明显降低，有显著统计学意义(P<0.01)；三酰甘油浓度明显降低,有显著统计学意义(P<0.01)；蛋白浓度无显著差别(P>0.05)，差异无统计学意义。结果见表1。

组 别海藻糖浓度/(mg/dL)三酰甘油浓度/(μg/mg)蛋白浓度/(mg/mL)空白组39．34±12．20 32．55±3．69 0．44±0．03模型组77．09±20．47△△42．74±2．44△ 0．49±0．03给药组43．16±5．29##27．70±2．48##0．51±0．04

注：与模型组相比，##P<0.01；与空白组相比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 鬼箭羽配伍荔枝核对高脂诱导的果蝇糖尿病模型体质量、海藻糖浓度、三酰甘油浓度、蛋白浓度的影响 模型组与空白对照组相比体质量无显著差别(P>0.05)，无统计学意义；海藻糖浓度明显升高，有统计学意义(P<0.05)；三酰甘油浓度明显升高，有显著统计学意义(P<0.01)；蛋白浓度无显著差别(P>0.05)，无统计学意义。给药组跟模型组相比体质量无显著差别(P>0.05)，无统计学意义；海藻糖浓度明显降低，有统计学意义(P<0.05)；三酰甘油浓度明显降低,有统计学意义(P<0.05);蛋白浓度无显著差别(P>0.05)，差异无统计学意义。结果见表2。

组 别体质量/mg海藻糖浓度/(mg/dL)蛋白浓度/(mg/mL)三酰甘油浓度/(μg/mg)空白组5．27±0．172．81±0．70 0．42±0．0332．55±3．69 模型组5．21±0．164．02±0．64Δ0．38±0．0452．20±3．92ΔΔ给药组5．09±0．163．01±0．70#0．45±0．0641．50±4．84#

注：与模型组相比，#P<0.05；与空白组相比，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3 结论

本实验结果表明，鬼箭羽配伍荔枝核对高糖和高脂诱导的果蝇糖尿病模型的海藻糖、三酰甘油浓度均有降低作用，鬼箭羽配伍荔枝核对高糖诱导的果蝇糖尿病模型的海藻糖浓度及三酰甘油浓度的降低效果更显著；表明鬼箭羽配伍荔枝核有很好的降糖作用；但对高糖和高脂诱导的果蝇糖尿病模型蛋白浓度均无降低的作用，而且与模型组相比，给药组的蛋白浓度均有一定程度的升高，文献报道，鬼箭羽是有小毒的，本实验中，在对高糖和高脂诱导的果蝇糖尿病模型的海藻糖、三酰甘油浓度降低的同时，对2种模型的蛋白浓度均无明显的影响，而且对高脂诱导模型的体质量也无影响，也从侧面说明了鬼箭羽配伍荔枝核在具有显著降糖的剂量下可能不产生明显的毒性，为临床安全用药提供了依据。

Matthieu Y等[2]在研究高糖食物诱导的果蝇胰岛素抵抗模型载脂蛋白神经元性质时发现：果蝇在胰岛素抵抗机制方面与人类基本相同。Palanker Mussel man L等[3]在对高糖食物会导致野生型果蝇肥胖和胰岛素抵抗研究时发现用高糖食物喂养后的果蝇，会出现胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)、空腹血糖和脂肪升高等2型糖尿病的症状。Sean Oldham[4]的研究也表明高脂食物诱导的果模型可以作为人类研究代谢疾病的有用模型，这些疾病包括高脂食物诱导的肥胖、糖尿病、心脏病。

国医大师周仲瑛教授对糖尿病及其并发症的治疗有独到的见解，创立了消渴病“瘀热致消”学说[5]。临床常用凉血化瘀中药治疗糖尿病。鬼箭羽和荔枝核是周老常用的一组对药,本研究以高糖和高脂诱导的果蝇2型糖尿病模型，符合人类糖尿病瘀热证候特点。实验证明,鬼箭羽配伍荔枝核对果蝇2型糖尿病模型的海藻糖浓度、三酰甘油浓度有较好的作用，对蛋白质无影响，是否和鬼箭羽毒性有关，有待探讨。

正如《血证论》所云：“瘀血在里则口渴。所以然者，血与气本不相离，内有瘀血，故气不得通，不能载水津上升，是以发渴，名曰血渴，疲去则不渴矣。”明确阐述了瘀血与消渴的关系。故凉血化瘀为糖尿病重要的治疗方法。

鬼箭羽，其性味功能为味苦性寒，有小毒，有清热破血消瘀、杀虫止痛之功。对其药理研究发现，鬼箭羽可以直接作用在胰岛B细胞上，促进胰岛B细胞群增生，释放胰岛素，促进组织中的葡萄糖代谢与加速肝糖原的合成，从而改善血糖水平[6]。荔枝核性甘、温、无毒，入肝、肾经,具有温中、理气、止痛的功效,主要成份有皂甙、蒜质、脂肪酸、氨基酸、挥发成分等。已有研究证实[7]，荔枝核水提物和醇提取物均具有降低糖尿病大鼠血糖水平、调节血脂、改善模型鼠高胰岛素血症和IR及抗氧化作用。临床上常用鬼箭羽配伍荔枝核加减治疗糖尿病及其并发症。本实验采用果蝇作为实验动物模型，作为经典的模式生物，果蝇在21世纪的遗传学研究中将发挥更加巨大而不可替代的作用。

对于哺乳动物模型而言，果蝇有着较少的冗余基因，利用保守的信号通路和代谢途径行使基本的代谢功能，从而利于发现基因在调控信号转导通路和代谢途径中的作用[8]。鬼箭羽和荔枝核的成分复杂多样，关于二者单药降糖降脂作用的报道有很多，虽然临床这2味药经常用于糖尿病治疗，但暂无对二者配伍降低血糖血脂的报道。发挥作用的药物成分也可能是多因素、多靶点、多途径综合作用的结果。其具体的降糖降脂机制和机理有待进一步深入研究。2型糖尿病(T2DM)是由遗传因素和环境因素共同引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征，2型糖尿病以胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能受损为特征。胰岛素缺乏和胰岛素作用障碍单独或同时引起糖类、脂肪、蛋白质、水和电解质等的代谢紊乱，临床以慢性高血糖为主要特征。2型糖尿病患者常有脂代谢紊乱,脂代谢异常又进一步加重糖代谢紊乱，二者互为因果关系。有效的控制血糖、调节血脂能减少糖尿病及其并发症的发生、发展，寻找有效的降糖同时兼有降脂疗效的药物，有着巨大的临床和社会意义。

[1]周仲瑛.论瘀热[J].南京中医药大学学报,2006,22(5):273-231.

[2]Matthieu Y,Pasco,Pierre le opold.High Sugar-Induced Insulin Resistance in Drosophila Relies on the Lipocalin Neural Lazarillo[J].PLoS One,2012(5):1-8.

[3]Palanker Mussel man L,Fink J L,Narzinski K.Ramac handran PV:A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila[J].Dis Model Mech,2011(4):842-849.

[4]Sean Oldham.Obesity and nutrient sensing TOR pathway in flies and vertebrates:Functional conservation of genetic mechanisms[J].Cell press,2011(2):45-52.

[5]周仲瑛.糖尿病杂谈[J].江西中医药,2001,32(2)15-16.

[6]姜志华.箭羽在治疗消渴病中的应用[J].中华中医药杂志,2007(增刊1):243-244.

[7]贾淑明,刘铜华.常用中药及其活性成份抗糖尿病的作用及机制[C]//第九次全国中医糖尿病学术大会论文汇编,石家庄:中华中医药学会糖尿病分会,2006.

[8]Baker KD,Thummel C S.Diabetic larvae and obese flies-emerging studies of metabolism in Drosophila[J].Cell Metab,2007(6):257-266.