商洛不同产地青翘和老翘中连翘苷及连翘酯苷A含量研究

宋小俊,雷 立,李惠民,李玉琴,高吉仁,何西珍,周曙东

(商洛职业技术学院，陕西 商洛 726000)

连翘入药在我国已有两千多年的历史，是我国临床常用传统中药之一，主产于我国陕西、山西、河南、山东等地。明清以后至今皆以木犀科连翘的果实为连翘正品的唯一来源[1]。秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，称之为“青翘”；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，称之为“老翘”[2]。中药材连翘主要含有连翘苷、连翘酯苷、异落叶松脂素、异橄榄脂素、芦丁、槲皮素等苯乙醇苷类、木脂素类、三萜类、黄酮类、酚酸类物质[3-5]。连翘苦，微寒，归肺、心、胆经，具有清热解毒，消痈散结，疏散风热的功效[6]。连翘具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤等作用[7-9]。主治温热、丹毒、斑疹、痈疡肿毒、瘰疬、小便淋闭等症；现代临床上多用于治疗呼吸道感染、急性肾炎、肝炎、脑膜炎等疾病[10]。连翘还是预防和治疗禽流感、SARS、甲型H1N1流感等流行性疾病的主要药物[2]。连翘是商洛市确定的“五大商药”之一，在商洛的蕴藏量大，分布区域广。本研究药材样品采自商洛连翘各主要产区。以连翘苷和连翘酯苷A含量为指标，按照中国药典标准,采用高效液相色谱法对不同区县青翘和老翘中连翘苷、连翘酯苷A含量进行比较研究。

1 实验材料

连翘果实采自商洛五县区7个样点。经西北农林科技大学梁宗锁教授鉴定均为正品。2011年7月采集样品，将所采连翘果实蒸熟、晒干，得“青翘”备用。2011年10月采集样品，将所采连翘果实晒干，除去杂质,得“老翘”备用。连翘苷及连翘酯苷A标准品均购自中国药品生物制品鉴定所，甲醇、乙腈等化学试剂均为色谱纯，冰醋酸为分析纯，试验用水为纯净水。LC-10AT岛津高效液相色谱仪，SPD-10A紫外-可见检测器，浙江大学N2000色谱工作站;WK-1000A型高速中药粉碎机(青州市精诚机械有限公司);AUW220型万分之一电子天平(SARTOO-RIUS公司)；KQ5200B型超声波清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司)；R501B型旋转蒸发仪(无锡市星海王生化设备有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司);电热恒温DGG-9203AD型鼓风真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 参照中国药典方法[6]作适当调整。色谱柱：C18(10 μm，250 mm×4.6 mm)；连翘苷流动相：乙腈-水(30∶70)；检测波长：277 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃。连翘酯苷A流动相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液(15∶85)；检测波长:333 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃。

2.2 对照品溶液的制备 分别取连翘苷及连翘酯苷A标准品适量，精密称定。于10 mL容量瓶中甲醇溶解，精确定容至刻度线，得对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取采自不同产地的青翘和老翘干燥粉末(过五号筛)各1.000 g，至50 mL锥形瓶中，加70%甲醇20 mL，过夜，超声波提取30 min，摇匀，滤过，静置,取上清液移入10 mL容量瓶中，稀释至刻度，得连翘苷供试品溶液。

精密称取采自不同产地的青翘和老翘干燥粉末(过五号筛)各1.000 g,至50 mL锥形瓶中，加70%甲醇20 mL，超声波提取30 min,摇匀，滤过，取上清液移入10 mL容量瓶中，稀释至刻度，得连翘酯苷A供试品溶液。

2.4 相关性分析 分别精密吸取连翘苷、连翘酯苷A对照品溶液0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 mL置l mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。依次吸取上述溶液10 μL，注入HPLC色谱仪，记录峰面积。以连翘苷、连翘酯苷A的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理得进样量浓度与峰面积的相关系数分别为，r(连翘苷)=0.998 9，r(连翘酯苷A)=0.999 1。表明连翘苷、连翘酯苷A含量和其峰面积之间有很好的相关性。

2.5 精密度试验 取连翘苷、连翘酯苷A对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积，结果连翘苷、连翘酯苷A的峰面积RSD分别小于1.624%，1.461%。表明试验用仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取新制备的供试品溶液10 μL，分别静置0、2、4、8、16、24 h,注入色谱柱，记录峰面积，结果青翘样品中连翘苷、连翘酯苷A质量分数的RSD值分别小于1.0%，1.18%；老翘样品中连翘苷、连翘酯苷A质量分数的RSD值分别小于1.14%，1.07%。说明样品在24 h内稳定性良好。

2.7 供试品含量测定 精密吸取药材供试品溶液10 μL进样，采用外标法计算，结果见表1、表2。

2.8 重现性试验 分别取青翘和老翘药材样品制备供试品溶液6份,依次进样，记录峰面积，各主要色谱峰相对保留时间均小于0.20%， 结果青翘样品中连翘翘苷、连翘酯苷A含量的RSD分别小于1.20%，1.26%；老翘样品中连翘苷、连翘酯苷A含量的RSD分别小于1.14%，1.12%。证明此方法重现性良好。

表1 不同产地青翘和老翘中连翘苷含量(n=3) %

表2 不同产地青翘和老翘中连翘酯苷A含量(n=3) %

2.9 回收率试验 精密称取样品1.000 g,分别加入连翘苷、连翘酯苷A标准品适量，按照2.3项方法制备供试品溶液，分别得到连翘苷、连翘酯苷A加样回收样品，测定,计算回收率。结果:青翘样品中连翘苷的平均回收率为99.54%，RSD为1.38%；连翘酯苷A的平均回收率为99.7%，RSD为1.72%。老翘样品中连翘苷的平均回收率为99.51%,RSD为1.34%；连翘酯苷A的平均回收率为99.64%，RSD为1.27%。

3 分析与讨论

连翘的药用成分较多，关于研究方法的报道也逐年增加。崔洋等[11]对连翘进行了高效液相色谱指纹图谱研究。吴艳芳等[12]对伏牛山区青翘与老翘中连翘苷含量进行了测定。朱小强等[13-14]对商洛连翘GAP栽培技术和增产效果进行了研究,但以商洛不同产地连翘药材为研究对象,结合药物分析对主成分连翘苷、连翘酯苷A进行分析研究尚未见报道。

本试验采用HPLC-RPBPCF法，对来自商洛五县区不同产地的青翘和老翘药材进行色谱分析。测定连翘苷、连翘酯苷A含量,采用外标法进行定量计算，并进行了精密度、稳定性、重现性和回收率试验。结果证明，该方法可靠，重复性好，供试品药材的主要成分连翘苷、连翘酯苷A含量高而且稳定。

各产地青翘中连翘苷含量均高于老翘，与吴艳芳研究结果一致[12]，不同产地青翘、老翘中连翘苷含量差异明显。

各产地青翘中连翘酯苷A含量均高于老翘，不同产地青翘、老翘中连翘酯苷A含量差异十分明显。

除洛南石门老翘样品中连翘苷含量为0.106%,其余样品中连翘苷含量均大于中国药典规定的0.15%[6]，最高含量达中国药典标准的5.5倍。所有样品连翘酯苷A含量均大于中国药典标准(0.25%)[6],且最高含量达中国药典标准的50倍左右，最低含量也超出中国药典标准约1.5倍。表明做为商洛“五大商药”之一的连翘，其药用主要成分含量极高，具有良好的开发价值。

由于不同产地连翘苷、连翘酯苷A含量差异较大,故在实施商洛连翘药材的人工种植时，必须重视种质的选择，建立GAP基地，掌握科学的采摘时间,以保证商洛道地药材的质量标准。

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