蒌芩止嗽煎对急性加重慢性阻塞性肺疾病痰热证大鼠抗生素增效的作用

王林洋，王成祥，李 杰

(北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

本课题在借鉴国内外对氨溴索(ambroxol)研究方法的基础上[1-3]，以西药氨溴索和中药化痰方二陈汤为对照，观察以清热化痰法指导下的蒌芩止嗽煎对AECOPD痰热证大鼠肺组织、血清及灌洗液中青霉素药物浓度的影响，即对抗生素增效作用的影响。

1 实验材料

Wistar雄性大鼠130只，体质量(200±20) g，合格证号SCXK(京)2009-0007，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。内毒素(L2880,由美国Sigma-Aldrich公司提供)；青霉素(华北制药有限公司生产)；金黄色葡萄球菌(北京中医药大学医学病原学与免疫实验室提供)；哈德门香烟(焦油含量12 mg，烟碱含量1.2 mg，由上海卷烟厂生产)；氨溴索(上海勃林格殷格翰药业有限公司)；甲醇、乙腈、正己烷(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；乙酸(分析纯，美国Fisher Scientific公司)；青霉素G标准品(纯度≥99%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；5 mol/L氢氧化钠；0.15 mol/L磷酸二氢钠水溶液。二陈汤方和蒌芩止嗽煎制备成免煎颗粒，由北京康仁堂药业有限公司提供。Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6490串联质谱仪(美国Agilent公司)，涡旋混合仪(Scientific Industries公司)，KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Avanti J-26 XPI离心机(Beckman Coulter公司)，Sigma 2-16 KL台式冷冻离心机(德国Sigma公司)，Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)；分析天平(梅特勒AG245，最小精度0.1 mg)；Oasis RHLB 30 μm固相萃取小柱(6 cc/150 mg，3 cc/60 mg，美国Waters公司)，0.2 μm GHP滤膜(美国PALL公司)。

2 实验方法

2.1 造模、分组及用药 用熏吸香烟加气管内注射内毒素的方法[4]建立大鼠COPD模型,分别于实验第7、14、28天向气管内注入溶于注射用生理盐水的内毒素200 μL(1 g/L)。第1～28天(第7、14、28天除外)上午将大鼠置入自制密闭的有机玻璃仓(30 cm×45 cm×50 cm)内，注入浓度约5%(V/V)哈德门香烟烟雾30 min/d，制备COPD大鼠模型。在COPD模型基础上，参照李建生[5]AECOPD痰热证模型建立方法，于第29天开始连续9 d置于温度(38±1) ℃、相对湿度50%、风速0.7 m/s的鼓风干燥箱中进行风热刺激，2次/d，每次30 min，建立痰热证模型,并于第38天经鼻腔注入金黄色葡萄球菌2.4×109cfu/mL)，2次/d，每次0.3 mL，连续滴注细菌3 d，制备AECOPD大鼠模型。模型制备后大鼠随机分成4组，即对照组、氨溴索组、二陈汤组和蒌芩止嗽煎组，每组各20只。每组分别予股四头肌肌内注射青霉素16万u/(kg·d)(与人体肌注量等效)，连续7 d；同时对照组予蒸馏水10 mL/(kg·d)灌胃，氨溴索组腹腔内注射氨溴索6 mg/(kg·d)，二陈汤组予二陈汤10 mL/(kg·d)(制备成免煎颗粒，每克生药配成3 mL混悬液)灌胃，蒌芩止嗽煎组予蒌芩止嗽煎剂10 mL/(kg·d)(制备成免煎颗粒，每克生药配成3 mL混悬液)灌胃。上述给药均每天2次。

2.2 采集生物标本 从造模后开始用药计算,分别于第8天肌注青霉素后15、30 min，每组随机处置动物各10只,留取动物标本,检测各组大鼠不同时段生物标本中青霉素的浓度。

2.2.1 血清 以3.5%水合氯醛0.1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血6 mL。

2.2.2 支气管肺泡灌洗液 麻醉大鼠仰卧固定于操作台上，放血处死大鼠,暴露出气管和双肺。在气管下部做横行切口，夹闭右主支气管，通过硅胶管用注射器从气管缓缓注入无菌生理盐水3 mL灌洗左肺，每次注入后立即回吸得到灌洗液，重复3次。灌洗液纱布(2层)过滤，回收率为80%～90%。回收过滤后的支气管肺泡灌洗液(BALF)置于塑料离心管中，周围用冰水(-4～0 ℃)包围。

2.2.3 肺组织 取大鼠4叶右肺，用预冷的无菌生理盐水冲洗3次，洗去凝血块,用滤纸吸干后称重，按W(重量)/V(体积)=1/5比例加入预冷的无菌生理盐水，置于玻璃匀浆器中研磨15 min，制成10%肺组织匀浆。所有标本立即于4 ℃下2 000 r/min离心15 min，取上清液-80 ℃保存待检。

2.3 样品前处理

2.3.1 肺组织样品前处理 称取一定量的肺组织匀浆置于50 mL离心管中,加入10 mL磷酸二氢钠缓冲溶液，均质，用10 mL磷酸二氢钠溶液洗涤均质器刀头后并入离心管中。于振荡器上震荡10 min，超声提取10 min。然后在4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上层液转移至另一离心管，加入10 mL正己烷，如上震荡离心后弃去上层正己烷层和脂肪，下层提取液过6 cc HLB固相提取小柱(预先用5 mL甲醇，5 mL超纯水活化)，5 mL水淋洗后抽干，最后用5 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于样品管中，氮气吹干后用乙腈-水(v∶v=1∶9)定容至1 mL,稀释100倍后过0.2 μm滤膜，供上机检测。

2.3.2 血清样品前处理 取50 μL血清样品于1.5 mL离心管中,加入950 μL乙腈涡旋混匀，8 000 r/min离心5 min。上清液全部转移至收集管中，氮气吹干后用2 mL乙腈-水(1∶9)溶解，过3 cc HLB固相提取小柱(预先用3 mL甲醇，3 mL超纯水活化)，3 mL水淋洗后抽干，最后用3 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于样品管中,氮气吹干后用乙腈-水(v∶v=1∶9)定容至1 mL，稀释20倍后过0.2 μm滤膜，待上机检测。

2.3.3 灌洗液样品前处理 取100 μL灌洗液样品于1.5 mL离心管中，加入900 μL乙腈涡旋混匀，8 000 r/min离心5 min。上清液全部转移至收集管中，氮气吹干后用2 mL乙腈-水(v∶v=1∶9)溶解,过3 cc HLB固相提取小柱(预先用3 mL甲醇，3 mL超纯水活化)，3 mL水淋洗后抽干，最后用3 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于样品管中，氮气吹干后用乙腈-水(v∶v=1∶9)定容至1 mL，稀释10倍后过0.2 μm滤膜，待上机检测。

2.4 标本测定 采用高效液相色谱-串联质谱法测定生物样品中青霉素浓度。

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)，配在线过滤器(Agilent公司)；流动相A为0.1%乙酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～70% B；1.5～3.0 min，70% B；3.0～3.1 min，70%～10% B；3.1～4.0 min，10% B；柱温：35 ℃；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL。

2.4.2 质谱条件 电离源：ESI-；毛细管电压：3 000 V；雾化气压力:20 psi；鞘气温度：300 ℃；鞘气流量：11 L/min；干燥气温度：250 ℃；干燥气流量：15 L/min；采集方式：多反应监测模式(MRM)。青霉素G质谱参数见表1。

表1 青霉素G质谱参数

3 结果

3.1 15 min标本中青霉素浓度 见表2。

表2 15 min标本中青霉素浓度 μg/L

注:※数据非正态分布，故用中位数表示；与对照组比较，△P=0.008<0.05；与氨溴索组比较，△P=0.043<0.05；与二陈汤组比较，△P=0.026<0.05；与对照组比较，△△P=0.000<0.05；与氨溴索组比较，△△P=0.000<0.05；与二陈汤组比较，△△P=0.009<0.05

3.2 30 min标本中青霉素浓度 见表3。

4 讨论

结合当前的研究文献及既往的研究经验，我们选择了大鼠肺组织、血清及灌洗液作为观察目标。通过提高抗生素在肺组织内的转运，提高其肺内感染区域的浓度，增加抗生素的治疗效能[6-7]。

东直门医院呼吸科在长期的临床实践中发现并提出气虚血瘀痰阻是COPD稳定期的核心病机[8-10]，而对于AECOPD,“痰”与“热”是其中关键病机[11-13]，清热化痰法是其基本治疗原则[14]。本课题正是基于此，并借鉴国内外研究思路，西药以氨溴索[15]为对照，中药以化痰方二陈汤为对照， 观察以清热化痰法指导的蒌芩止嗽煎[16]对抗生素在肺组织中的药物浓度的影响，即对抗生素的增效作用的影响。蒌芩止嗽煎由《统旨方》中清金化痰汤加减组成。方中瓜蒌、黄芩、清半夏、浙贝母清热化痰；漏芦、连翘清热解毒；杏仁、前胡宣降肺气。

表3 30 min标本中青霉素浓度 μg/L

注:※数据非正态分布，故用中位数表示；与对照组比较，△P=0.055>0.05；与氨溴索组比较，△P=0.181>0.05；与二陈汤组比较，△P=0.753>0.05；与对照组比较，△△P=0.235>0.05；与氨溴索组比较，△△P=0.963>0.05；与二陈汤组比较，△△P=0.283>0.05

实验结果显示，在肺组织标本中，AECOPD痰热证大鼠模型在肌注青霉素15 min后组织药物浓度以蒌芩止嗽煎组最高，提示清热化痰法能提高AECOPD痰热证大鼠肺组织中的青霉素浓度，并且疗效优于二陈汤，以及可以提高抗生素在肺组织内转运的氨溴索。而30 min时肺组织中药物浓度各组间比较无统计学意义，但蒌芩止嗽煎组与二陈汤组肺组织药物浓度均高于氨溴索组和对照组，提示中药化痰法对提高青霉素在肺组织中的转运有一定的疗效。综合分析，基于清热化痰法的蒌芩止嗽煎可以提高肺组织中青霉素药物浓度，且以15 min时最明显，而单纯应用化痰法治疗AECOPD痰热证起效相对较慢，提示对AECOPD痰热证，在化痰基础上及早应用清热药物可以提高组织药物浓度，从而提高治疗效果。在血清标本中，也有类似结果，进一步提示，清热化痰药物对AECOPD血清及肺组织药物浓度的影响具有一致性，及早应用针对AECOPD痰热证核心病机的清热化痰药物有助于提高药物浓度，提高治疗效果，缩短治疗时间。而在灌洗液药物浓度测定中发现，不管是15 min组还是30 min组，提示蒌芩止嗽煎可以提高抗生素在肺灌洗液中的浓度，并加速抗生素在灌洗液中的分布，延长起效作用时间。

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