多囊卵巢综合征妊娠大鼠种植窗期子宫内膜HOXA10表达及药物干预作用

刘音吟

(南京中医药大学附属江苏省中医院,南京 210029)

多囊卵巢综合征(PCOS)是引起月经失调、不孕的常见内分泌障碍性疾病。PCOS患者经药物等方法纠正排卵后，虽能获得较高的受孕率，但仍存在低临床妊娠率、高流产率的现象。笔者在对PCOS的临床治疗中发现，促排卵治疗结合泰山磐石散补肾健脾、地屈孕酮健黄体，均能降低早期流产率，减少早期妊娠丢失的发生。子宫内膜容受性是指母体子宫内膜处于一种允许胚泡黏附、穿透并植人的状态，着床窗口期即是指这段子宫内膜容纳胚泡植入的时间[1]。大量研究发现胚泡着床障碍是导致临床妊娠率低的主要原因之一,而子宫内膜容受性降低又是阻碍胚泡着床的主要因素之一。近年的研究也表明，HOXA10参与胚胎着床的多个环节,如子宫内膜的增殖与分化、子宫内膜容受性的建立、胚胎的定位及黏附等[2]。HOXA10上调是子宫内膜具有容受性的必要条件，可以作为衡量子宫内膜接受性的分子标志[3]。本研究采用半定量RT-PCR及Western blot法,观察多囊卵巢综合征大鼠配合CC促排妊娠后，经泰山磐石散、地屈孕酮治疗后着床期子宫内膜HOXA10mRNA及蛋白的改变，从子宫内膜容受性的角度，认识PCOS促排治疗后易发生低临床妊娠率的可能原因；围绕内膜容受因子HOXA10，探讨泰山磐石散、地屈孕酮减少早期妊娠丢失的可能作用机制，证实中西药治疗的有效性、可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物 21日龄正常健康雌性SD大鼠90只,及80日龄正常健康雄性SD大鼠20只,均由南通大学实验动物中心提供。在12h光照和12h黑暗的条件下喂养,环境温度22～24 ℃，自由采食和饮水。

1.2 建立PCOS模型及分组 将80只21日龄断乳雌鼠随机分为对照组(20只)和PCOS模型组(70只)，适应性喂养2 d后,于23日龄(实验第1天)开始。采用Anderson等[4]方法制作DHEA诱导PCOS大鼠模型。PCOS模型组大鼠每日上午定时颈背部皮下注射DHEA 6 mg/100 g体质量+0.2 mL注射用大豆油，对照组大鼠每日颈背部皮下注射0.2 mL注射用大豆油,连续30 d。模型组于注射第20天时开始每天观察阴道涂片，经阴道涂片显示大鼠始终处于动情间期，无动情周期变化、无排卵；于第30天PCOS模型组和对照组全部雌性大鼠，眼眶静脉采血，模型组血清激素睾酮值升高为造模成功。

1.3 建立正常妊娠模型及PCOS促排妊娠模型 将20只对照组大鼠自80日龄起以生理盐水10 mL/kg体质量/d，连续灌胃5 d后与雄鼠按2∶1合笼，次日检查以发现阴栓记为妊娠第1天，记为d 1；将对照组妊娠大鼠作为A组。将70只PCOS模型组大鼠于80日龄起用CC灌胃4.5 mg/kg体质量/d，1次/d，连续5 d促排。促排结束后，将PCOS促排组与雄鼠按2∶1合笼，次日检查以发现阴栓记为妊娠第1天，记为d 1。将PCOS促排妊娠大鼠随机分为3组：1)PCOS促排+生理盐水组(B组)从妊娠d1开始加用0.9%生理盐水,按10 mL/kg体质量/d灌胃，连续灌胃至处死前；2)PCOS促排+中药组(C组)，从妊娠d 1开始泰山磐石散颗粒剂(党参10 g，白术10 g，白芍12 g，熟地黄10 g，当归8 g，川芎8 g，续断15 g，黄芩10 g，炙甘草3 g，砂仁5 g，苎麻根10 g)，按91 mg/kg体质量/灌胃，连续灌胃至处死前；3)PCOS促排+西药组(D组)，从妊娠d 1开始加用地屈孕酮，按1.8 mg/kg体质量/d灌胃，直至处死前。

1.4 制备标本 于妊娠d 5分别取A组、B组、C组、D组4组大鼠，每组6只,以颈椎脱臼处死，取双侧子宫，刮取子宫内膜-80 ℃保存备用，用作RT-PCR和 Western blot检测。

1.5 半定量RT-PCR测定HOXA10 1)采用美国Invitrogen公司提供的Trizol reagent，按照试剂盒说明从子宫内膜中提取总RNA。2)在260 nm下测定所提取的RNA的紫外吸收OD值，计算RNA含量。质量较好的RNA一般OD260/OD280值为1.6～1.8之间并且在1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中可以看出28 S和18 S两条清晰的带,且亮度比约为2∶1。将RNA稀释至OD260为0.010。3)取5 μL RNA，离心管内加入oligo(dT)15、5×RT buffer、dNTP、RNA酶抑制剂、无菌水,在反转录酶M-MLV(美国Promega公司)作用下反转录成cDNA。4)在genebank里面找到目的基因的全序列(或者mRNA序列)，用Primer5软件设计相关引物，引物由美国Promega公司提供，见表1。5)以cDNA产物为模板、GAPDH作为内参照进行PCR。反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，目的基因退火55 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s。6)PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色后，在凝胶影像分析仪(Bio-Rad ChemiDoc XRS)上进行成像，并对条带进行吸光度分析。计算待测基因与GAPDH的比值,从而得到待测基因的相对表达值。

表1 引物序列以及PCR产物大小

1.6 Western blot检测HOXA10蛋白表达 总蛋白提取及蛋白定量:将少量子宫内膜组织三去污细胞裂解液于匀浆器中匀浆。裂解30 min后，在4 ℃下12 000 r/min离心5 min,取上清，用蛋白定量试剂计算蛋白浓度。样品加入上样缓冲液，100 ℃加热5 min使蛋白变性。Tris-Glycine电泳缓冲液以100 V恒压凝胶电泳。95 mA，75 min，将分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上转膜。一抗孵育，用PBS-T洗膜2次，使用阻断剂37 ℃孵育1 h,置于稀释的特异性抗体反应液4 ℃过夜。二抗孵育，用PBS-T洗膜3次,加入含1∶5 000稀释的过氧化物酶酶联二抗反应液，37 ℃摇动孵育2 h。PBS-T洗膜3次，5 min/次。加ECL-plus发光显色液，室温作用1 min后暗盒曝片。显影之后根据Western Blot彩色标准电泳指示条带的位置，分析所测电泳条带的性质。电泳条带经Image J软件处理，分析各实验组条带与对照组条带面积、灰度比值，进一步用SPSS 16.0软件进行统计分析。

2 实验结果

2.1 4组妊娠大鼠种植窗期子宫内膜HOXA10 mRNA的表达 4组妊娠大鼠种植窗期HOXA10 mRNA均有表达，A组HOXA 10mRNA表达最高,B组最低。A组、D组中的表达明显高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)；C、D组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表2。

图1 4组种植窗期子宫内膜HOXA10mRNA的表达

表2 各组种植窗期子宫内膜HOXA1 0mRNA表达比较

2.2 4组妊娠大鼠种植窗期子宫内膜HOXA10蛋白的表达 各组妊娠大鼠种植窗期HOXA10蛋白表达与mRNA表达结果相似，但组间差异更明显。A组HOXA10蛋白表达最高，B组最低。A组中HOXA10的蛋白表达均高于B、C、D组，差异有统计学意义(P<0.05)；B组中HOXA10的蛋白表达均低于A、C、D组，差异有统计学意义(P<0.05)；而C、D组中HOXA10的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图2。

表3 各组种植窗期子宫内膜HOXA10蛋白表达比较

图2 4组种植窗期子宫内膜HOXA10蛋白的表达

3 讨论

同源框基因(homeobox,HOX)属于多基因家族的转录调节基因，具有控制胚胎发育和调节细胞分化的作用，其中HOXA10基因主要表达于子宫，HOXA10表达异常将影响子宫内膜的发育和妊娠。Taylor[5]研究发现,HOXA10在整个月经周期人子宫内膜腺上皮和基质细胞中均有表达，并在分泌中、晚期表达达高峰，而分泌中期正值胚泡植入期。动物实验证实[6]，HOXA10-/-小鼠可以存活，但表现为不孕，其能正常排卵并受精，但胚泡不能着床或植入后不久即死亡并被吸收。本研究也表明，PCOS促排妊娠大鼠种植窗期子宫内膜HOXA10的表达明显低于正常妊娠组，提示PCOS“着床期”子宫内膜HOXA10的低表达，使子宫内膜存在潜在缺陷，影响胚泡的着床，这可能也是临床上PCOS促排治疗后高排卵率、低临床妊娠率、高早期流产率的原因之一。

孕酮是妇女妊娠必不可少的激素，它支持卵巢黄体的功能，使增殖期子宫内膜转化为分泌期,利于胚胎着床和发育。乔杰等[7]收集了45例多囊卵巢综合征不孕症患者，发现促排前后有排卵的患者大部分存在黄体功能不足，从而推测黄体功能不全及间质发育不良是多囊卵巢综合征高排卵低妊娠率的原因之一。有研究表明，孕激素可通过上调HOXA10基因促进子宫内膜上皮和基质的分化，使子宫内膜从增生期向分泌期转化，利于胚胎着床和发育[8]。

泰山磐石散出于明代徐春甫所辑《古今医统大全》，方中党参、黄芪补益脾肾之气；熟地黄、白芍、川芎益肾阴、养阴血；续断助肾阳、安胎; 白术与黄芩健

脾清热，为安胎要药，且黄芩又能缓参、芪之温热，白术可防地、芍之滋腻；砂仁理气醒脾，与白术相协使诸药补而不滞。全方补肾健脾，补气养血；既滋肾阴，又助肾阳，受孕后能够安胎，减少早期流产的发生。

本研究发现，泰山磐石散、地屈孕酮均能上调PCOS促排妊娠大鼠种植窗期子宫内膜HOXA-10表达，但二者之间差异无统计学意义。泰山磐石散、地屈孕酮可能通过增强内膜HOXA10的表达，改善内膜容受不良的状态，利于胚胎着床,提高临床妊娠率、减少早期妊娠丢失。

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[6]Benson G V,Lim H,Paria B C,et al.Mechanisms of reduced fertility in Hoxa-10 mutant mice:uterine homeosis and loss of maternal Hoxa-10 expression[J].Development,1996,122(9):2687-2696.

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