慢病毒介导的CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞生长和迁移的影响*

孙 湛， 巩雪俐， 冉新建， 马 琪， 龙 梅△

(新疆医科大学基础医学院 1机能中心实验室， 2病理生理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830054)

脑血管疾病(cerebrovascular disease, CVD)是指由于各种脑血管病变所引起的脑部病变，发病率和致残率很高，给患者和家庭带来痛苦和沉重的负担，其治疗关键是改善缺血区的血供，挽救濒死的神经元。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)能够促进半暗带血管新生,有效改善半暗带血供，从而挽救濒死神经元，故已成为治疗缺血性脑损伤的研究热点。慢病毒载体尤其适用于干细胞，具有目的基因可整合到染色体上，稳定表达时间较长，不易引发宿主免疫反应等诸多优点。

富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1)是即刻早期基因编码的富半胱氨酸蛋白，是近年发现的一种分泌型基质信号蛋白[1]，能上调多种生长因子的表达，如VEGF及转化生长因子等；能促进内皮细胞黏附、增殖和迁移，调节血管生成[2]。本研究通过设计并构建出携带有含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)及大鼠CCN1目的基因的慢病毒表达载体，观察外源性CCN1能否促进BMSCs的生长和迁移，为BMSCs移植治疗缺血性脑损伤提供理论基础。

材 料 和 方 法

1 动物和材料

6～8周龄雄性Wistar大鼠1只，体质量120 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

STBL3感受态细胞、基因过表达慢病毒载体、慢病毒转染试剂和293T细胞为辉骏生物公司产品；高纯度质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、总RNA提取试剂盒和Quant一步法RT-PCR试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品；限制性核酸内切酶为Ferentas产品；PrimeScript反转录酶、PCR扩增试剂盒和DL2000 DNA marker为大连TaKaRa产品；T4 DNA连接试剂盒为Promega产品；KOD Plus DNA聚合酶为Toyobo产品；低糖DMEM和胎牛血清为Gibco产品；Cyr61/CCN1 Ⅰ抗为Santa Cruz产品；MTT为博士德产品；其余试剂为国产或进口化学纯或分析纯。

2 方法

2.1载体的构建和鉴定 根据大鼠CCN1 mRNA序列(NCBI GenBank，基因编号：NM_031327.2)，全基因合成CCN1基因(CDS区域序列)并基因测序验证。引物由上海生工合成，上游引物5’-GCGGAATTCTGCGCGCCACAATGAGCTC-3’，划线部分为EcoR I酶切位点；下游引物5’-GACGGATCCCCTTTAGTCCCTGAACTTGTG-3’，划线部分为BamH I酶切位点。将全基因合成的CCN1构建至过表达载体CAG-MCS-EF1-copGFP，并转化至感受态细胞DH5α，氨苄青霉素筛选培养，平板分别挑取4个克隆，用过表达载体通用引物进行菌落PCR筛选。筛选得到的阳性克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与CDS区域的基因序列一致。选取符合预期大小扩增片段，送测序验证。

2.2过表达慢病毒的包装 取对数生长期细胞293T细胞，按照6× 106个细胞数接种于10 cm培养皿中。转染前2 h将培养基更换为不含双抗DMEM+10%FBS培养基，37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h。将包装质粒和构建好的慢病毒表达载体在生理盐水中混合，并加入转染试剂，孵化20 min后缓慢均匀滴入培养皿中并混匀，于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养8 h。倒去含有转染混合物的培养基，PBS洗涤，更换含有100 mL/L小牛血清的新鲜培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。转染48～72 h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞发光(绿色荧光)情况，待确认转染成功后，反复冻融细胞收集上清液，3 000～4 000 r/min离心15 min，用0.45 μm微孔滤器过滤去除所有的细胞及碎片，浓缩得到高浓度的慢病毒浓缩液，-80 ℃保存。

2.3孔稀释法测定病毒滴度 滴度测定前1 d，为培养好的293T细胞换液，并将其接种至96孔板中，每孔的细胞数目约为(0.3～1.0)×104个，培养基体积为100 μL/well。将10 μL病毒上清按梯度稀释10～106倍，将稀释好的病毒液100 μL依次加到细胞孔中，继续放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。48 h后，每孔分别加入新鲜培养基100 μL。96 h后观察荧光表达情况，数出最后2个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数；病毒原液的滴度值=荧光细胞个数/稀释后的病毒量。

2.4大鼠BMSCs分离及培养 采用贴壁筛选法获取大鼠BMSCs，将Wistar大鼠断颈处死，无菌条件下剪取四肢骨骼，用低糖DMEM反复冲洗大鼠四肢骨髓腔，将含有骨髓细胞的培养液1 500 r/min离心10 min，弃去上清，用含10%FBS的DMEM低糖培养基重悬并接种于培养皿中。在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。接种培养约24 h后换液，弃去未贴壁细胞。以后隔天换液，连续3次后改为每周换液2次。每天观察细胞形态并作记录。原代培养的细胞铺满整个培养瓶底面约80%时，即可用0.125%胰酶将贴壁细胞消化分离，然后按照1∶2比例传代接种培养，以此获得大鼠BMSCs，采用第3代细胞进行实验。

2.5CCN1慢病毒转染大鼠BMSCs 将第3代大鼠BMSCs进行胰酶消化，将细胞悬液(细胞数约为4×105)接种在24孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到约80%后，将Lenti-GFP-CCN1按感染复数(MOI)=1×106v.g./cell加入DMEM培养基中，同时加入4～8 mg/L polybrene增强转染。转染BMSCs 96 h后观察GFP基因的表达情况。

2.6Western blotting检测大鼠BMSCs中CCN1蛋白的表达 Lenti-GFP和Lenti-GFP-CCN1感染BMSCs，收集细胞上清液，Lenti-GFP感染细胞为阴性对照，未处理为空白对照，Western blotting法检测CCN1蛋白表达。BCA法测定样本的蛋白浓度，制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。电泳结束后进行膜处理、转膜。5% 脱脂奶粉4 ℃封闭过夜；加入Ⅰ抗4 ℃过夜；PBS洗膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(稀释度1∶6 000)，室温孵育1 h弃Ⅱ抗，PBS室温振摇洗膜3次，每次10 min。加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

2.7CCN1对BMSCs生长的影响 采用MTT比色实验。收集BMSCs细胞，调整细胞数为1×108/L，按100 μL/well接种于96孔板中，37 ℃、5% CO2培养8 h后加入Lenti-GFP，Lenti-GFP-CNN1感染BMSCs 96 h后，滴加2 g/L MTT(50 μL/well)，继续培养4 h，吸出孔内培养液后，加入DMSO液(150 μL/well)，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶溶解，在570 nm波长测定吸光度(A)值，每个浓度重复5孔。

2.8划痕愈合实验检测BMSCs迁移 对照孔和实验孔分别以Lenti-GFP和Lenti-GFP-CNN1感染BMSCs，48 h 后更换为含 0.5%胎牛血清的培养液并做划痕标记，显微镜下记录不同时点细胞向划痕迁移情况。按公式计算该划痕不同时点的愈合速率。愈合速率(%)=(初始划痕宽度值-相应点划痕宽度值) /初始划痕宽度值×100%。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CCN1基因克隆PCR产物凝胶电泳结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，基因片段的大小为1 140 bp，与预期一致，见图1。

Figure 1. Amplification of the gene fragment of CCN1 by PCR.M: DNA marker; 1: CCN1 PCR product.

2 CCN1慢病毒转染BMSCs

Lenti-GFP-CCN1转染BMSCs，在倒置荧光显微镜下观察,染24 h时可以观察到部分绿色荧光，转染96 h时，GFP表达明显增加，见图2。

Figure 2. The cell transfected efficiency at different time points (×100). A: 24 h; B: 48 h; C: 96 h.

3 Lenti-GFP-CCN1转染BMSCs

Lenti-GFP和Lenti-GFP-CCN1转染BMSCs，收集细胞上清液，Lenti-GFP转染细胞为阴性对照，未处理为空白对照，Western blotting法检测表明CCN1成功重组到慢病毒中，见图3。

Figure 3. Expression of CCN1 in BMSCs transfected with Lenti-GFP-CCN1.Lane 1: non-transfection group; Lane 2: negative control group (transfected with Lenti-GFP); Lane 3: transfection group (transfected with Lenti-GFP-CCN1).

4 CCN1对BMSCs细胞存活率的影响

MTT比色结果显示，Lenti-GFP-CCN1转染BMSCs后4 d，细胞存活率较空白组及Lenti-GFP组增加，但差异没有统计学意义(P>0.05)，见图4，表明CCN1对正常细胞存活率没有显著影响。

Figure 4. Effect of CCN1 on proliferation of BMSCs.Mean±SD.n=5.

5 CCN1对细胞迁移能力的影响

划痕损伤4 d后，与空白组及Lenti-GFP 组细胞相比，Lenti-GFP-CCN1转染组的细胞更趋于愈合，CCN1明显增强了BMSCs的迁移能力，见表1。

表1 CCN1对大鼠BMSCs细胞划痕愈合程度的影响

讨 论

脑血管病是发病率和致残率很高的疾病,其治疗关键是改善缺血区的血供，挽救濒死的神经元。干细胞能够促进半暗带血管新生,有效改善半暗带血供，从而挽救濒死神经元，故已成为治疗缺血性脑损伤的研究热点[3-5]。然而，缺血损伤区大量的氧自由基能明显抑制BMSCs与损伤区的血管内皮细胞及细胞外基质的黏附，导致BMSCs“失巢性凋亡”并限制其促进血管新生的作用[6]。失巢凋亡是由于细胞与细胞外基质和其它细胞失去接触而诱导的一种程序化死亡形式，发生在BMSCs在移植到缺血半暗带的起始阶段。因此，只有能够与细胞外基质黏附，具有抗失巢凋亡能力的BMSCs才能在脉管系统中生存下来，才能发挥治疗作用。

Cyr61/CCN1是即刻早期基因编码的富半胱氨酸蛋白，它与细胞表面和细胞外基质有关，是一种基质相关蛋白，可与肝素和多种细胞整合素相互作用，受多种因素调节，如生长因子、 激素、 药物等。可介导细胞信号转导、 细胞黏附、 迁移和趋向性，促进细胞存活和血管形成。基质信号蛋白CCN1可能在调控内皮祖细胞增殖、分化，参与血管发生中扮演重要角色。在成体血管组织中，CCN1几乎在所有血管细胞包括内皮、平滑肌和纤维细胞等都有表达，诱导内皮细胞的增殖和迁移是CCN1促进血管生成的直接作用[7-8]。

慢病毒载体是在人Ⅰ型免疫缺陷病毒基础上，对其特异性基因骨架进行改造而形成的。慢病毒载体能利用自身逆转录酶和整合酶将自身RNA转录为cDNA整合到宿主细胞染色体中，使其有效表达外源基因，是当前基因治疗中载体研究的热点之一，对分裂细胞核非分裂细胞均具有感染能力，能在体内长时间稳定表达，安全性好[9]。本研究中我们构建带有绿色荧光蛋白的重组慢病毒Lenti-GFP-CCN1，通过倒置荧光显微镜观察，重组慢病毒随着感染BMSCs时间的延长，其感染效率也会随之增高，96 h时达到最高。分别用重组慢病毒Lenti-GFP-CCN1和Lenti-GFP感染细胞，应用MTT比色法检测吸光度值，各组间吸光度值未见显著差异，表明外源性CCN1对正常细胞的存活率没有明显影响。另外，我们通过划痕愈合实验证实外源性的CCN1可以促进大鼠BMSCs细胞划痕的愈合。综上分析，CCN1修饰BMSCs后可以促进BMSCs的生长与迁移，为外源性CCN1促进BMSCs的迁移作用及其机制研究奠定了基础，并可望为缺血性脑病的基因治疗奠定基础。

[参 考 文 献]

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[2] Grote K, Salguero G, Ballmaier M, et al. The angiogenic factor CCN1 promotes adhesion and migration of circulating CD34+progenitor cells: potential role in angiogenesis and endothelial regeneration[J]. Blood, 2007, 110(3):877-885.

[3] Iwanami J, Mogi M, Li JM, et al. Deletion of angiotensin II type 2 receptor attenuates protective effects of bone marrow stromal cell treatment on ischemia-reperfusion brain injury in mice[J]. Stroke, 2008, 39(9):2554-2559.

[4] Liaudet L, Rosenblatt-Velin N. Role of innate immunity in cardiac inflammation after myocardial infarction[J]. Front Biosci (Schol Ed), 2013, 5: 86-104.

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[7] Hasan A, Pokeza N, Shaw L, et al. The matricellular protein cysteine-rich protein 61 (CCN1/Cyr61) enhances physiological adaptation of retinal vessels and reduces pathological neovascularization associated with ischemic retinopathy[J]. J Biol Chem, 2011, 286(11):9542-9554.

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