离子对液相色谱法测定柴枳四逆散中 辛弗林的含量

邱红+胡筱梅

（湖北医药学院附属东风医院检验科，湖北十堰442008）

[摘要]目的：建立测定柴枳四逆散中辛弗林含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱条件为Fortis C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流动相为甲醇-磷酸二氢钾溶液（43：57），流速为1.0ml·min-1，柱温：30℃，检测波长为275nm。结果：辛弗林在1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）浓度范围内有良好的线性关系，平均加样回收率为98.0%，RSD 为1.50%。结论：本方法准确，重复性好，可用于柴枳四逆散中辛弗林的测定。

[关键词]辛弗林；柴枳四逆散；离子对高效液相色谱法

中图分类号：R284.1文献标识码：B文章编号：2095-5200（2014）04-069-03

DOI：10.11876/mimt201404022

Determination of synephrine in Caizhi Sini Powder by Ion-Pair HPLCQIU Hong，HU Xiao-mei.（Department of clinical laboratory, Affiliated Dongfeng Hospital, Hubei Medical University, Hubei Shiyan 442008, China）

[Abstract]Objective：To establish a method for the determination of synephrine in Caizhi Sini Powder. Method：The RP-HPLC system consisting the Fortis C18（4.6×250mm, 5μm）column, the mobile phase consisted of MeOH –KH2PO4 (43: 57), the flow rate was 1.0ml·min-1, the column temperature was 30℃,The UV detector was set at 275nm. Results：The linear response range was 1.82～36.40μg·ml-1（r=0.9999）.The average recovery of schisandrin was 98.0%, RSD was 1.50%. Conclusions：The assay demonstrated that the method was simple and accurate, repeatable, it can be applied in determination of schisandrin in synephrine in Caizhi Sini Powder.

[Key words]synephrine；Caizhi Sini Powder；Ion-Pair-HPLC柴枳四逆散为原国家卫生部部颁药品标准收载中药成方制剂[1]，以柴胡、枳实、白芍、甘草4味中药所组成。具有疏肝理脾之功效。主要用于热厥手足不温，胸胁痞满，下痢腰痛等症候。枳实为方中君药性苦；辛；寒。归脾；胃；肝；心经。具有，消痰癖，祛停水，逐宿食，破结胸，通便闭之功效。主要用于积滞内停；痞满胀痛；大便秘结；泻痢后重；结胸等病症。现代药理研究表明，枳实含有丰富的黄酮类、维生素、有机酸、类黄酮等成分[2]。枳实提取物、枳实注射液及其有效成分对羟福林（辛弗林）有强心、增加心输出量、收缩血管、提高总外周阻力，而使左室压力和动脉血压上升的作用[3]。辛弗林除具有升压、抗休克作用外，还具有提高新陈代谢、增加热量消耗、提高能量水平、氧化脂肪、减肥作用[4]。

本方原质量标准中尚无含量测定项，为更确切研究本方剂的药理作用与枳实用量的关系，本研究建立了高效液相色谱法测定方中主药枳实的活性成分辛弗林的含量，现将具体方法报道如下。

1仪器与试药

Dionex-U3000液相色谱仪（德国Dionex公司，U3000 二极管阵列检测器，Dionex Chemeleon色谱工作站），SK5200H超声波清洗机（超声仪器有限公司）；梅特勒MS105DU型电子天平（d=0.01mg）；辛弗林（1110727 - 20 0306，供含量测定用，由中国食品药品检定研究院提供，纯度≥98.5%），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。柴枳四逆散及阴性空白制剂（自制，规格：10g/袋）。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备

使用电子分析天平，精密称定经真空干燥减压器中减压恒重干燥的辛弗林适量，加水制成每1ml含36.4μg的溶液。

2.2供试品溶液及阴性对照溶液的制备

精密称定本品2.0g，置锥形瓶中，密塞，精密加入50mL甲醇，称定重量，加热回流1.5h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，通过聚酰胺柱（60～90目，2.5g，内径为1.5cm，干法装柱），用水25mL洗脱，收集洗脱液，转移至25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.3色谱条件

色谱柱： Fortis C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：甲醇-磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾0.6g，十二烷基磺酸钠1.0g，冰醋酸1mL，加水溶解并稀释至1000mL）（43：57）[5-9]；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：275nm；进样量：10μL。在此色谱条件下，辛弗林理论塔板数不小于3000，色谱图见图1。柴枳四逆散中其他成分对辛弗林的含量测定无影响。

2.4标准曲线与线性范围

吸取辛弗林溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0mL置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，混合均匀，辛弗林浓度分别为1.82、3.64、7.28、18.20、29.12、36.40μg·mL-1，分别进样10μL，按以上色谱条件进行分析，以辛弗林色谱峰面积（Y）对辛弗林对照品浓度（X）进行线性回归，结果： Y=1.2596X-0.0457，r=0.9999，线性范围为1.82～36.40μg·mL-1。

2.5精密度试验

照“2.3”项下条件准备色谱分析，连续测试同一辛弗林对照品溶液6次，记录辛弗林色谱峰面积，结果显示辛弗林相对保留时间一致，辛弗林色谱峰面积的RSD为1.16%，说明实验精密度好。

2.6稳定性试验

取同一批柴枳四逆散，照“2.2供试品溶液制备”项下操作，制备供稳定性测试的供试品溶液，室温下取该供试品溶液分别在0，2，4，8，12、24h分析测定，计算辛弗林色谱峰面积RSD为1.48%，结果说明处理后的柴枳四逆散供试品在24h内稳定性好。

2.7重复性试验

称取柴枳四逆散（批号20110508）6份，按“2.2供试品溶液制备”项下操作，制备供重复性测试的供试品溶液，每份柴枳四逆散制备2个供试品溶液，每个供试品溶液连续测定两次，记录辛弗林色谱峰面积，用外标两点法计算辛弗林在柴枳四逆散中的含量，并将所得含量结果计算平均含量为1.02mg·g-1，RSD为1.58%。显示本实验的重复性好。

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2.8加样回收率试验

精密称取柴枳四逆散（批号：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三种不同浓度精密加入辛弗林对照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供试品溶液制备”项下操作，制备供加样回收率试验的供试品溶液，按相同色谱条件分析，测定辛弗林色谱峰面积，计算本实验中辛弗林的加样回收率，结果见表1。

2.9样品测定

按上述色谱条件对5批样品进行测定，外标两点法计算含量，结果见表2。

表2样品测定结果（n=3）

批号 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3结论

通过对5批柴枳四逆散中辛弗林的含量测定，结果辛弗林的平均含量为1.04mg·g-1。中国药典2010年版一部规定枳实中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方为复方制剂，加上制剂过程中的损耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的标准，用于本制剂的质量控制。

4讨论

4.1离子对试剂的选择

使用HPLC法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子。离子对试剂种类和浓度对分离效果都有较大的影响。辛弗林为弱碱性,在普通色谱柱上不易保留，分离效果很差。选用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂并且加入冰醋酸调节流动相使成酸性获得较为满意的辛弗林分离效果。

4.2选用聚酰胺柱层析法制备供试品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生吸附作用。辛弗林分子中羟基的数目和位置决定了吸附的强度。实验过程中曾发现聚酰胺层析流速慢及低分子杂质（聚酰胺）混入的问题。采取预先过筛除去聚酰胺细粉或与硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子杂质的干扰，则在装柱时先用10%盐酸预洗除去聚酰胺中的小分子杂质。

参考文献

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂：第十二册[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

[2]肖培根. 新编中药志 (二卷) [M]. 2版.北京：化学工业出版社，2002：459- 460.

[3]Bouchard N, How landM, Greller H, et al Ischemic stroke associated with use of an ephed A-free dietary supplement containing synephrine[C]. Mayo Clinic，2005, 80(4): 541- 545.

[4]官福兰, 王如俊. 枳壳中辛弗林对小鼠胃排空、小肠推进功能的影响[J]. 现代中西医结合杂志，2002，11(11): 1001-1003..

[5]国家药典委员会.《中国药典》（一部）[S]. 中国医药科技出版社，2010，230．

[6]赵宇, 谢培山, 卢平华, 等. 枳实、 枳壳、 青皮和陈皮等药材中辛弗林含量测定研究[J]. 世界科学技术-中药现代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC测定小儿消积止咳口服液中辛弗林、氢溴酸槟榔碱的含量[J].中国中药杂志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛爱玲，王嘉林. HPLC法测定木香顺气丸中辛弗林的含量[J]. 安徽医药，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鸣, 吴永宗, 朱良辉, 等. 不同产地枳壳中柚皮苷及辛弗林含量测定[J].中药材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加样回收率试验

精密称取柴枳四逆散（批号：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三种不同浓度精密加入辛弗林对照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供试品溶液制备”项下操作，制备供加样回收率试验的供试品溶液，按相同色谱条件分析，测定辛弗林色谱峰面积，计算本实验中辛弗林的加样回收率，结果见表1。

2.9样品测定

按上述色谱条件对5批样品进行测定，外标两点法计算含量，结果见表2。

表2样品测定结果（n=3）

批号 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3结论

通过对5批柴枳四逆散中辛弗林的含量测定，结果辛弗林的平均含量为1.04mg·g-1。中国药典2010年版一部规定枳实中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方为复方制剂，加上制剂过程中的损耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的标准，用于本制剂的质量控制。

4讨论

4.1离子对试剂的选择

使用HPLC法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子。离子对试剂种类和浓度对分离效果都有较大的影响。辛弗林为弱碱性,在普通色谱柱上不易保留，分离效果很差。选用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂并且加入冰醋酸调节流动相使成酸性获得较为满意的辛弗林分离效果。

4.2选用聚酰胺柱层析法制备供试品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生吸附作用。辛弗林分子中羟基的数目和位置决定了吸附的强度。实验过程中曾发现聚酰胺层析流速慢及低分子杂质（聚酰胺）混入的问题。采取预先过筛除去聚酰胺细粉或与硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子杂质的干扰，则在装柱时先用10%盐酸预洗除去聚酰胺中的小分子杂质。

参考文献

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂：第十二册[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

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[3]Bouchard N, How landM, Greller H, et al Ischemic stroke associated with use of an ephed A-free dietary supplement containing synephrine[C]. Mayo Clinic，2005, 80(4): 541- 545.

[4]官福兰, 王如俊. 枳壳中辛弗林对小鼠胃排空、小肠推进功能的影响[J]. 现代中西医结合杂志，2002，11(11): 1001-1003..

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[6]赵宇, 谢培山, 卢平华, 等. 枳实、 枳壳、 青皮和陈皮等药材中辛弗林含量测定研究[J]. 世界科学技术-中药现代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC测定小儿消积止咳口服液中辛弗林、氢溴酸槟榔碱的含量[J].中国中药杂志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛爱玲，王嘉林. HPLC法测定木香顺气丸中辛弗林的含量[J]. 安徽医药，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鸣, 吴永宗, 朱良辉, 等. 不同产地枳壳中柚皮苷及辛弗林含量测定[J].中药材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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2.8加样回收率试验

精密称取柴枳四逆散（批号：20110508，辛弗林含量：1.02mg·g-1）9份，每份1.0g，每份柴枳四逆散中按高、中、低三种不同浓度精密加入辛弗林对照品（36.4μmg·mL-1）25、28、30mL，照“2.2供试品溶液制备”项下操作，制备供加样回收率试验的供试品溶液，按相同色谱条件分析，测定辛弗林色谱峰面积，计算本实验中辛弗林的加样回收率，结果见表1。

2.9样品测定

按上述色谱条件对5批样品进行测定，外标两点法计算含量，结果见表2。

表2样品测定结果（n=3）

批号 辛弗林（mg·g-1）

20110508 1.02

20110514 1.05

20110519 1.03

20110523 1.07

20110530 1.03

3结论

通过对5批柴枳四逆散中辛弗林的含量测定，结果辛弗林的平均含量为1.04mg·g-1。中国药典2010年版一部规定枳实中辛弗林的含量不低于3.0mg·g-1。由于本方为复方制剂，加上制剂过程中的损耗，因此可制定柴枳四逆散中辛弗林的含量不低于1.0mg·g-1的标准，用于本制剂的质量控制。

4讨论

4.1离子对试剂的选择

使用HPLC法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子。离子对试剂种类和浓度对分离效果都有较大的影响。辛弗林为弱碱性,在普通色谱柱上不易保留，分离效果很差。选用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂并且加入冰醋酸调节流动相使成酸性获得较为满意的辛弗林分离效果。

4.2选用聚酰胺柱层析法制备供试品

主要是由于聚酰胺分子中酰胺基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生吸附作用。辛弗林分子中羟基的数目和位置决定了吸附的强度。实验过程中曾发现聚酰胺层析流速慢及低分子杂质（聚酰胺）混入的问题。采取预先过筛除去聚酰胺细粉或与硅藻土混合制粒，提高流速；而低分子杂质的干扰，则在装柱时先用10%盐酸预洗除去聚酰胺中的小分子杂质。

参考文献

[1]卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂：第十二册[S].WS3-B-2404-97，Z12-54.

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[4]官福兰, 王如俊. 枳壳中辛弗林对小鼠胃排空、小肠推进功能的影响[J]. 现代中西医结合杂志，2002，11(11): 1001-1003..

[5]国家药典委员会.《中国药典》（一部）[S]. 中国医药科技出版社，2010，230．

[6]赵宇, 谢培山, 卢平华, 等. 枳实、 枳壳、 青皮和陈皮等药材中辛弗林含量测定研究[J]. 世界科学技术-中药现代化，2003，28(5) ：64-67.

[7]康四和.HPLC测定小儿消积止咳口服液中辛弗林、氢溴酸槟榔碱的含量[J].中国中药杂志，2011，36（10）：1298-1300.

[8]魏清芳，辛爱玲，王嘉林. HPLC法测定木香顺气丸中辛弗林的含量[J]. 安徽医药，2010，14（11）：1290-1292.

[9]肖鸣, 吴永宗, 朱良辉, 等. 不同产地枳壳中柚皮苷及辛弗林含量测定[J].中药材, 2000, 23( 5 ): 267- 268.

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