新辅助化疗对改变非小细胞肺癌微环境的临床意义

蔡 云 罗庆丰 高 玟 詹勤元 郭善娴

新辅助化疗对改变非小细胞肺癌微环境的临床意义

蔡 云 罗庆丰 高 玟 詹勤元 郭善娴

目的 探讨新辅助化疗对改变非小细胞肺癌微环境的临床意义。方法 采用MaxvisionTM免疫组化法和TUNEL方法，检测51例非小细胞肺癌的凋亡指数和微血管密度。结果 51例非小细胞肺癌的凋亡指数平均值为10.59，与患者性别、年龄、肿瘤分型、临床分期和肿瘤淋巴结转移无关，与接受新辅助化疗治疗密切相关(t值=2.11，P=0.04，P<0.05),51例非小细胞肺癌MVD值平均为33.53，其MVD值与患者性别、年龄、肿瘤分型、临床分期和肿瘤淋巴结转移无关，与接受新辅助化疗治疗密切相关(t值=4.55，P=0.00，P<0.01)。结论 凋亡指数和MVD值能反应非小细胞肺癌新辅助化疗的治疗效果，新辅助化疗可合理用于非小细胞肺癌临床个体化治疗。

凋亡指数；微血管密度；新辅助化疗； 非小细胞肺癌微环境

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1583～1585)

肺癌是人类发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤，尤其是非小细胞肺癌，单一的治疗方案并不令人满意，5年生存率约为10%。设计综合的个体化治疗对于提高非小细胞肺癌的治疗效果具有重要的临床意义，采用新辅助化疗方法是近期研究的热点，通过研究接受新辅助化疗患者的凋亡指数和微血管密度的肿瘤微环境改变来判断新辅助化疗的疗效，指导临床个体化治疗方案制定具有重要的临床价值。

1 资料与方法

1.1 资料与方法

收集江西省肿瘤医院2009年10月至2010年12月收入住院的51例非小细胞肺癌患者，年龄32～77岁，平均年龄62.5岁，患者均经病理组织学检查诊断，其中高中分化鳞状细胞癌3例，低分化鳞状细胞癌18例，中分化腺癌10例，低分化腺癌20例。17例接受新辅助化疗(NP方案:NVB 25 mg/m2静脉滴注,第1、5天,DDP 30 mg/m2静脉滴注,第1～3天 )患者为实验组，同期住院的34例未接受新辅助化疗为对照组。

1.2 TUNEL检测方法

①石蜡切片脱蜡至水；②0.3%H2O2的甲醇液室温作用5 min，0.01 mol/l PBS清洗两次，每次5 min；③20 μg/ml蛋白酶K处理，湿盒内37 ℃孵育30 min，PBS清洗，④加入TUNEL反应混合液50 μl,盖上薄膜，湿盒内37℃孵育1 h，PBS清洗，⑤ 3% BSA室温作用20 min,PBS清洗；⑥POD转换液50 μl,盖上薄膜，湿盒内37℃孵育30 min，PBS清洗；⑦DAB显色5～10 min，自来水冲洗，；⑧苏木精复染，盐酸酒精分化20 s，自来水冲洗20 min；⑨梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%，2 min/次，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察计数。

1.3 MaxvisionTM免疫组化法

按照免疫组化试剂盒的操作说明进行。CD34抗体为工作液，由美国基因公司提供，具体步骤：① 4 μm连续切片，裱于涂有APES的载玻片上，70 ℃烤片2 h;② 二甲苯脱蜡，梯度酒精入水；③ 3%过氧化氢室温孵育30 min，消除内源性过氧化物酶；④ 抗原修复：切片浸于pH6.0柠檬酸溶液中，电饭锅中煮沸5 min，保温10 min，自然冷却；⑤ PBS洗 5 min×2次；⑥ 加入适当稀释倍数的一抗，4 ℃冰箱12 h；⑦ 复温，PBS洗去一抗；⑧ 加Maxvision试剂，室温作用1 h；⑨ PBS洗2次；⑩ DAB显色，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片光镜下观察抗原在间质微血管中表达。

1.4 结果判断

细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。凋亡指数(apoptosis index,AI) 的计算:显微镜下(400倍)选取4个凋亡细胞数高视野,分别计数100个肿瘤细胞中凋亡细胞数，计算凋亡细胞数与总细胞数之比。

CD34阳性为血管壁细胞核棕黄色颗粒沉着，光镜下观察抗原在间质微血管中表达，在200倍显微镜下记数3个视野的MVD，计算平均数。

1.5 统计学分析

采用t检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

51例非小细胞肺癌凋亡指数平均值为10.59，与患者性别、年龄、肿瘤分型、临床分期和肿瘤淋巴结转移无关，与治疗效果密切相关(t值=2.11，P=0.04，P<0.05)。51例非小细胞肺癌的MVD平均值为33.53，其MVD值与患者性别、年龄、肿瘤分型、分期和肿瘤淋巴结转移无关，与治疗效果密切相关(t值=4.55，P=0.00，P<0.01)，见表1。

表1 非小细胞肺癌凋亡指数及MVD值与其临床病理参数的关系

3 讨论

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤特别非小细胞肺癌存在转移早，预后差，确诊时大多为中晚期，单纯手术治疗效果并不令人满意。目前大量的研究证明应用新辅助化疗的综合治疗方案，能使患者得到良好的治疗效果。通过对接受新辅助化疗患者的局部微循环状态研究，探索新辅助化疗在非小细胞肺癌治疗中的价值。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用，是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程[1]。孙明等[2]研究认为细胞凋亡与P53基因控制有关。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。凋亡是多基因严格控制的过程，射线、化疗药物能够诱发细胞凋亡[3]，特别是增殖能力较强的肿瘤细胞，通过研究接受新辅助化疗患者的肿瘤细胞的凋亡状态，能够很好的反应治疗效果，研究发现接受新辅助化疗患者的凋亡指数明显低于未接受新辅助化疗患者，其结果具有非常显著性差异，该结果在和祝淮阳等[4]临床研究结果一致。

血管生成是肿瘤侵袭性生长和转移的必备条件之一，新生血管不仅为肿瘤细胞的增殖提供养分，而且是肿瘤细胞进一步侵袭的重要途径[5]。新生血管数量(MVD值)作为反应肿瘤血供的客观指标，早期肿瘤生长缓慢,主要靠周围组织的弥散作用提供营养,随着毛细血管的生成,使肿瘤能够获得足够的氧和营养物质而迅速生长,并通过血管浸润周围脏器发生远处转移,MVD值的增高与肿瘤营养供给丰富，有利于肿瘤的生长和转移,所以肿瘤的MVD与它的生物学行为息息相关，本研究结果显示MVD值与转移无关，只显示两组有差别，可能与所选样本中无转移样本过少有关，需加大样本进一步研究。有学者研究了放化疗、新辅助化疗、内分泌治疗对肿瘤微血管密度的影响，初步的研究结果肯定了通过抑制肿瘤血管形成起到治疗肿瘤的作用[6-8]，这为肿瘤的治疗提供又一新手段。

几乎在所有癌症，细胞凋亡失调、细胞增殖失控及肿瘤微环境的改变在肿瘤发生的过程中起了主要作用。因此用免疫组化法检测间质新生血管数量和检测肿瘤细胞凋亡指数，综合判断新辅助化疗在非小细胞肺癌综合治疗中的意义，为非小细胞肺癌的防治开辟一个新的途径，特别是为非小细胞肺癌术后的设计个体化综合治疗提供依据，有较好的社会效益和经济效益。

[1] Tormanen U,Eerola AK,Raino P,et al.Enhanced apoptosis predicts shortened survived in non-small cell lung carcinoma〔J〕.Cancer Res,1995,55(23):5595-5602.

[2] 孙 明，姜大力，陈 雷,等.肺癌细胞凋亡和P53蛋白表达的临床意义〔J〕.临床和实验医学杂志，2007,6(6)：35-36.

[3] 杜志强，李宇清，秦建勇,等.Endoglin表达和MVD检测与肺癌凋亡指数及临床病理特性相关研究〔J〕.中国实用医药，2012，7(35)：21-22.

[4] 祝淮阳，熊 瑜.术前热疗联合灌注化疗对肺癌细胞凋亡及相关基因的影响〔J〕.实用老年医学,2012,26(5)：394-397.

[5] 罗庆丰，黄传生，高 玟，等.血管内皮生长因子表达及微血管生成在判断原发性肝癌转移潜能中意义〔J〕.江西医药，2006,12(42)，958-960

[6] 弥海宁，何科基，杨言苹,等.结直肠癌动脉灌注新辅助化疗后PCNA和MVD表达临床意义的观察〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2011,18(5)：351-354.

[7] 明平坡，戈 伟，介芳芳,等.恩度联合放疗对Lewis肺癌小鼠 MVD 及αvβ3 mRNA 表达的影响〔J〕.实用肿瘤学杂志，2014，28(1)：1-6.

[8] 周 鹏，罗红兵，左佳明,等.肺癌灌注参数与肿瘤血管密度及纵隔淋巴结转移相关性分析〔J〕.四川医学，2013,34(5)：582-585.

(编辑：吴小红)

Clinical Significance of Neoadjuvant Chemotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Microenvironment

CAIYun,LUOQingfeng,GAOWen,etal.

JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To discuss the clinical significance of neoadjuvant chemotherapy in non-small cell lung cancer microenvironment.Methods MaxvisionTMimmunohistochemistry and TUNEL were used to detect the apoptosis index and microvessel density (MVD)in 51 cases of non-small cell lung cancer.Results Mean apoptosis index of 51 cases of non-small cell lung cancer was 10.59,apoptosis index had no relation with gender,age,tumor type,clinical stage and lymph node metastasis,and it was closely related with neoadjuvant chemotherapy(t=2.11，P=0.04，P<0.05).Mean MVD of 51 cases of non-small cell lung cancer cases was 33.53,MVD had no relation with gender,age,tumor type,clinical stage and lymph node metastasis,and it was closely related with neoadjuvant chemotherapy (t=4.55，P=0.00，P<0.01).Conclusion Apoptosis index and MVD can indicate the efficacy of neoadjuvant chemotherapy for non-small cell lung cancer.Neoadjuvant chemotherapy can be reasonably used in the treatment of non-small cell lung cancer.

Apoptosis index;Microvessel density (MVD);Neoadjuvant chemotherapy;Non-small cell lung cancer microenvironment

330029 江西省肿瘤医院

罗庆丰

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.023

R734.2

A

1001-5930(2014)12-1583-03

2014-09-20

2014-10-20)