鼻咽癌微卫星不稳定性与其预后相关性的临床研究

张相国 李警锋 何宗师 徐 达 黄 伟 廖卫坚

鼻咽癌微卫星不稳定性与其预后相关性的临床研究

张相国 李警锋 何宗师 徐 达 黄 伟 廖卫坚

目的 探讨鼻咽癌微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)意义及其与预后的关系。方法 随机抽取经病理检查确诊的鼻咽癌初治病例98例。取鼻咽癌组织和口腔脱落细胞，Chelex-100法提起DNA，用PCR方法对15个染色体基因(D8S1179、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、D21S11、D7S820、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA)进行扩增，扩增产物经电泳分离和激光扫描分析，STR基因座检测，基因分型，确定是否存在变异。结果 98例鼻咽癌石蜡组织与口腔脱落细胞基因型分析对比，8例表现微卫星不稳定性，占8.16%，7例为单个位点变异，1例为两个基因位点变异。其中D18S51出现MSI共3例，D16S539出现MSI共6例。Ⅱ～Ⅳ期患者均有MSI发生，Ⅱ期2例，Ⅲ期2例，Ⅳ期4例。鼻咽癌MSI与患者年龄、性别、T分级、TNM分期、颈部淋巴结转移、颅底侵犯、病理类型等均无显著相关性(P>0.05)；用McNemar检验比较两类变异位点情况，P>0.05为无显著相关性；生存曲线提示鼻咽癌MSI患者较未发生MSI患者预后好。但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 鼻咽癌存在MSI现象，MSI可能是其预后的重要生物学因素，MSI可为鼻咽癌个体化治疗提供理论依据。

鼻咽肿瘤；微卫星不稳定性；意义；预后

(ThePracticalJournalofCancer，2014，29：1522～1525)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方常见的一种恶性肿瘤，又叫“广东瘤”，侵袭力强且易早期发生颈部淋巴结转移，侵袭和转移是其独立预后因素。鼻咽癌已成为威胁生命安全的主要疾病之一。目前肿瘤研究已经进入了基因水平，肿瘤的发生、发展、分期、浸润、转移多与患者基因表达相关[1]。近10余年来，对于MSI的检测技术已经日趋成熟，从而使我们可以进一步了解肿瘤的发生发展。现代肿瘤学说认为，癌症是在分子水平至少出现多次遗传学变化。遗传不稳定性是引起这些变化的可能机制。因此，研究鼻咽癌基因变异对于进一步了解鼻咽癌的发生发展有积极意义，同时也是预防和治疗该病的基础，具有重要的临床意义。本研究对98例患者鼻咽癌蜡块组织和口腔脱落细胞基因座分型对比分析微卫星不稳定性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2011年3月至2013年5月经确诊并行3D-CRT或IMRT放疗的鼻咽癌患者98例。入组标准：①年龄22～75岁且PS评分≤2分。②按照鼻咽癌(2008广州分期)分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期；③经病理检查确诊为鼻咽癌，且尚未进行任何抗癌治疗(放化疗)的初治者；④行鼻咽+颅底MR平扫+增强检查证实具有可测量的肿瘤病灶；⑤均有保存完好的鼻咽癌石蜡病理标本，取入组患者口腔脱落细胞作为基因分型正常对照。⑥无明显放化疗禁忌者及并发症。从患者出院后开始定期随访，随访日期截至2014年9月，98例患者中11例失访。

1.2 DNA提取

1.2.1 鼻咽癌石蜡组织的DNA提取 经过病理检查确诊的组织蜡块，事先将肿瘤区域标示出来，每个样本以约(4.0～5.0)cm2×5.0 μm的组织量为宜，使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡组织至离心管中，尽量避免碎片组织飞散造成交叉污染，使DNA从细胞核中释放，蛋白酶K消化组蛋白，消化裂解过夜，过程中至少重复加入10 mg/mL蛋白酶K 4 μL两次，其中每次时间间隔1小时以上。通过离心，石蜡将悬浮于裂解液上层，吸取石蜡层下的溶液，注意在吸取时应尽量避免吸入石蜡等污染物，用Qiagen吸附柱收，将DNA置于-20°C冰箱保存备用。

1.2.2 口腔脱落黏膜细胞中的DNA提取 用无菌棉签刮拭口腔黏膜3～4次，将其放入1.5 ml无菌离心管内，加入1 ml双蒸水，反复挤压搅伴，目的使细胞脱落，10 000 r/min离心3 min，倒掉上清液，沉淀物加入TE缓冲液100 μl，随后高速振荡5～10 s，悬浮沉淀，沸水再煮10 min后冰浴3～5 min，高速振荡5～10 s，10 000 r/min离心3 min，然后取上清液用于扩增反应，4℃保存或-20°C冻存剩余DNA。

1.3 DNA分析

将提取的DNA样本用ABI Identifier试剂盒对15个染色体基因(D8S1179、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、D21S11、D7S820、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA)进行PCR扩增，扩增体系为25 μl。扩增体系包括：混合物(Reaction Mix)为10 μl，引物(Primer Set)为5 μl，DNA样本9.5 μl，Tap聚合酶( DNA Polymerase)为0.5 μl，扩增循环28次，扩增结束后取扩增后的产物2 μl，用3130XL遗传分析仪检测，得到各个样本的STR分型。

1.4 统计学分析

应用SPSS 18.0 统计学软件进行统计学处理。变异位点与年龄、性别、T分级、TNM分期、颈淋巴结转移、颅底侵犯、病理类型等的比较用χ2检验，用Kaplan—Meier法绘制生存曲线，并以Log-rank法进行检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌石蜡组织与口腔脱落细胞基因分析对比

98例鼻咽癌石蜡组织与口腔脱落细胞基因分析对比，8例表现微卫星不稳定性，占8.16%，7例为单个位点变异，1例为两个基因位点变异。其中D18S51出现MSI共3例，D16S539出现MSI共6例。Ⅱ～Ⅳ期都有MSI发生，Ⅱ期2例，Ⅲ期2例，Ⅳ期4例。

2.2 基因座D16S539及D18S51与其临床特征的关系

鼻咽癌MSI患者基因座D16S539及D18S51与患者年龄、性别、T分级、TNM分期、颈部淋巴结转移、颅底侵犯、病理类型等均无显著相关性(P>0.05)；见表1。

2.3 两类变异位点出现情况比较

D16S539 、D18S51两类变异位点出现情况比较采用McNemar检验，P>0.05，结果示无显著相关性，见表2。

2.4 两组生存曲线比较

两组生存曲线随着生存时间的延长，生存曲线从1.0～0逐渐呈阶梯状下降；生存曲线表明鼻咽癌MSI组生存率稍高于未发生MSI组，提示鼻咽癌MSI患者较未发生MSI患者预后好，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

表1 基因座D16S539及D18S51与鼻咽癌临床特征的关系/例

表2 两类变异位点出现情况比较/例

注：χ2=0.571，P=0.453。

图1 基因变异组与基因未变异组患者的生存曲线比较

3 讨论

微卫星是一类高度多态性的遗传标记，由2～6个核苷酸组成的具有高度多态性的简单串联排列的DNA序列。MSI是指肿瘤组织与其相应非肿瘤组织相比，其结构性等位基因的大小发生改变，即微卫星重复单元的增加和丢失。当有无位点不稳定时判定为肿瘤微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)；出现1个位点不稳定为低频率MSI( low-frequent MSI，MSI-L)；≥2 个位点出现不稳定，为高MSI( high-frequent MSI，MSI-H)[2]。遗传不稳定性是实体瘤的常见表现[3]。已经有很多肿瘤被证明与MSI有关，如原发性食管癌和原发性头颈部肿瘤、肺癌、男性泌尿系统肿瘤、女性生殖系统肿瘤、儿童胚胎性肿瘤等[4-5]。在MSI-H肿瘤中，对MSI发生发展机制的研究已经取得了较大进展。大量研究发现，MSI在肺癌、食管癌、膀胱癌早期诊断方面具有很高的特异性，并且伴有MSI的结直肠癌及食管癌病人预后好于不伴有MSI的患者。MSI首先是在遗传性非息肉性结直肠癌中被发现的，以后在各种散发性肿瘤中发现MSI现象。结直肠癌目前在国内外发病率均逐渐升高，成为危害人类生命的重要疾病，且遗传倾向明显，是目前人类恶性肿瘤中遗传变化最明显的肿瘤。近年研究发现MSI与结直肠癌发病密切相关，并与结直肠癌患者临床病理特点及预后相关。他们认为约15%的大肠癌存在这种突变，这种基因的不稳定性与DNA 错配修复基因功能缺陷有密切的关系。MSI的结直肠患者具有独特的临床病理特征，如低分化、黏液腺癌等[6-7]。近年来有学者提出[8-9]MSI及其他分子标记物可预测结直肠癌患者化疗敏感性，同时也可成为判断预后的指标，可为个体化治疗提供理论依据，但目前尚需大样本的前瞻性临床试验进一步证实。鄢践等认为[10]几乎所有实体瘤都存在遗传不稳定现象。该研究用染色体l6g22-24 上的8对微卫星多态性标记分析50例鼻咽癌的MSI与杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。结果：至少一个位点发生MSI的发生率为18%(9/50)，LOH的肿瘤占48%(24/50 )。这些变化仅散在性分布，其变化在早期(Ⅰ、Ⅱ期)和晚期(Ⅲ、Ⅳ期)患者之间有显著性差异(P<0.05)。结论：鼻咽癌的染色体l6g22-24 区存在遗传不稳定性，它可能对鼻咽癌发病有一定影响。大量研究已证实散发性实体癌中的MSI现象，但对其在肿瘤癌变过程中的意义及其产生机制并不了解。有人认为MSI是基因组不稳性的一种类型，正是这种不稳定性使细胞易于转化的遗传学改变。也有人认为癌症是1种增变子表型(mutator phenotype)，微卫星不稳定性是增变子表型的标志。目前MSI的产生及肿瘤的关系得到广泛地研究，但仍存在许多需要解决的问题[2]。

目前研究鼻咽癌在MSI方面的研究并不常见。本研究98例鼻咽癌石蜡组织与口腔脱落细胞基因分析对比，8例表现微卫星不稳定性，占8.16%。7例为单个位点变异，1例为2个基因位点变异。其中D18S51出现MSI共3例，D16S539出现MSI共6例。Ⅱ～Ⅳ期都有MSI发生，Ⅱ期2例，Ⅲ期2例，Ⅳ期4例。鼻咽癌MSI患者与年龄、性别、T分级、TNM分期、颈部淋巴结转移、颅底侵犯、病理类型等均无显著相关性(P>0.05)；用McNemar检验比较两类变异位点情况，P>0.05，无显著相关性；生存曲线提示鼻咽癌MSI患者较未发生MSI患者预后好。但差异无统计学意义(P>0.05)。与文献报道的多种常见散发性癌症的MSI的大致相似。

综上所述，鼻咽癌MSI者可能有较好的预后趋势。但本研究结果毕竟是阴性，分析不足之处①人类正常基因组至少携带10 万个微卫星，约有1.5万个标志物包含人所有染色体，MSI可能出现在多个基因片段。本研究标记的微卫星位点少，且病例不多，其中失访了11例，可能还不能使结果达到统计学差异的最小样本量。②STR基因变异检测过程的标准化及结果的观察与对比的准确性，使研究结果存在一定的偏倚。因此，鼻咽癌存在MSI现象，MSI可能是预后的重要生物学因素，MSI可为鼻咽癌个体化治疗提供理论依据。MSI对鼻咽癌预后的影响仍有待进一步深入研究。

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(编辑：吴小红)

Clinical Study of Significance of Nasopharyngeal Carcinoma Microsatellite Instability and Its Relationship with Prognosis

ZHANGXiangguo，LIJingfeng，HEZongshi，etal.

YuebeiPeople'sHospitalAffiliatedtoShantouUniversity，Shaoguan，512026

Objective To explore the significance of nasopharyngeal carcinoma microsatellite instability ( MSI) and its relationship with prognosis.Methods 98 cases of nasopharyngeal carcinoma confirmed by pathological diagnosis

initial treatment.Nasopharyngeal carcinoma tissues and exfoliated cells in oral were colleced.Chelex - 100 method was used to extract DNA，and polymerase chain reaction (PCR) was used to amplificate 15 chromosome gene (D8S1179，CSF1PO，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539，D2S1338 and D19S433，D21S11，D7S820，VWA，TPOX，D18S51，D5S818，FGA).Amplification product received electrophoresis separation，laser scanning，STR loci detection，and genotyping，determine whether there was variation.Results 98 cases of nasopharyngeal carcinoma paraffin tissues and oral exfoliated cells underwent genotype analysis，8 cases showed microsatellite instability，accounting for 8.16%.7 cases had a single locus mutation，1 case had 2 gene loci mutation.D18S51 had MSI in 3 cases，D16S539 had MSI in 6 cases.Ⅱ～Ⅳ period all has MSI，Ⅱ period had 2 cases，Ⅲ period had 2 cases，and Ⅳ period had 4 cases.Nasopharyngeal carcinoma MSI had no relation with age，sex，T stage，TNM staging，neck lymph node metastasis，skull base invasion and pathological types (P> 0.05)；McNemar test was used to compare 2 kinds of mutation sites，P> 0.05，there had no significant correlation；Survival curve showed that nasopharyngeal carcinoma with MSI had better prognosis than that without MSI，there was no statistically significant difference (P> 0.05).Conclusion MSI exists in nasopharyngeal carcinoma，and MSI may be an important biological prognostic factor.MSI can provide theoretical basis for individualized treatment of nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal cancer；Microsatellite instability；Significance；Prognosis

广东省卫生厅重点科研项目(编号：A2012687)；韶关市医药卫生科研计划项目(编号：Y12154)；韶关市科技局科研项目(编号：2012CX/K54)

512026 汕头大学附属粤北人民医院放疗科(张相国，黄伟，廖卫坚)；512000 韶关市公安局刑事科学技术研究所(李警锋，何宗师，徐 达)

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.004

R739.63

A

1001-5930(2014)12-1522-04

2014-09-21

2014-10-30)