血浆EB病毒DNA检测对鼻咽癌诊断的价值研究

陈文学 邹学森 李金高 龚小昌 袁 霞 敖 帆

血浆EB病毒DNA检测对鼻咽癌诊断的价值研究

陈文学 邹学森 李金高 龚小昌 袁 霞 敖 帆

目的 探讨血浆 EB病毒水平对鼻咽癌的诊断价值。方法 收集112例鼻咽癌初诊患者外周血,分离血浆,应用荧光定量 PCR法检测 EB病毒 DNA。结果 血浆中EB病毒DNA阳性率与患者性别无相关性。30-60岁鼻咽癌患者血浆中EB病毒DNA阳性率明显高于60岁以上者(P<0.05)。鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA阳性率为74.11%，随着鼻咽癌患者临床分期增加，血浆中EB病毒DNA阳性亦增强。结论 血浆EB病毒DNA水平与鼻咽癌患者临床分期呈正相关关系，血浆EB病毒DNA的检测可以辅助鼻咽癌的诊断。

鼻咽癌;Epstein-Barr病毒;DNA

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1526～1528)

EB病毒感染是鼻咽癌的发生的高危因素，众多研究显示鼻咽癌组织和鼻咽癌转移的淋巴结中均可检出EB病毒[1]。1998年Mutirangura等[2]报道鼻咽癌患者外周血中可以检测到EB病毒DNA，且拷贝数明显高于正常人。外周血EB病毒DNA检测可能成为鼻咽癌早期诊断的一种方法。我们运用荧光定量PCR方法检测江西省112例鼻咽癌初诊患者血浆中游离EB病毒DNA，分析在鼻咽癌诊断。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2012年3月-2013年12月本院收治的鼻咽癌初治患者112例,平均年龄 48.5 (21～72)岁。全部患者经鼻咽活检病理证实为鼻咽癌，病理类型均为低分化鳞癌。所有患者均接受鼻咽、颈部CT扫描，电子鼻咽镜及胸部正侧位片，腹部B超及相关实验室检查以明确分期及远处转移，若患者有骨痛症状则行全身骨扫描。临床分期按92分期标准进行TNM分期。

抽取患者2 ml外周血置于 EDTA抗凝管，全血经3 000转/分钟离心，分离获得血浆，-20 ℃保存备用。

1.2 试剂和仪器

EB病毒核酸扩增荧光检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)，荧光定量核酸扩增仪( 达安基因DA7600)。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 严格按照EB病毒核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作进行DNA提取。取50 μl血浆置灭菌管中，加入50 μl DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理(10±1) min，4℃过夜，次日12 000转离心5 min，-20 ℃保存备用。

1.3.2 引物探针及反应体系 所扩增的目的片段来自EB病毒的EBNA-1片段。上游引物，下游引物及探针由达安基因试剂盒自带，探针序列5′标记荧光发射基团FAM，3′标记荧光淬灭基团TAMRA。

1.3.3 反应循环参数设置 93 ℃，2 min；93 ℃，45 s，55 ℃，60 s，10个循环；93 ℃，30 s，55 ℃，45 s(采集荧光信号)，30个循环。

1.3.4 反应的质量控制 每次操作都做EBV阴性质控品，EBV临界阳性质控品，EBV强阳性质控品，定量参考品(107IU/ml,106IU/ml,105IU/ml,104IU/ml，103IU/ml)。PCR扩增结束后，EBV阴性质控品为阴性，EBV临界阳性和强阳性质控品在质控范围内，定量参考品的相关系数在0.98以上，此实验有效，如果有一项不在范围内，实验无效，重做。

1.3.5 判断标准 所有定量结果分为四个等级，阴性≤500 IU/ml，弱阳性501～20 000 IU/ml，阳性20 001～1 000 000 IU/ml,强阳性≥1 000 001 IU/ml。

1.4 统计分析

应用SPSS 10.0软件进行统计学分析。不同性别组、年龄组中鼻咽癌患者EB病毒阳性率的比较用卡方检验，鼻咽癌患者EB病与临床分期的相关性采用Spearman 相关秩和检验。

2 结果

2.1 定量标准曲线的建立

实时荧光定量PCR仪在每个循环检测一次荧光信号，荧光信号的多少与PCR的产物量呈正相关关系。PCR反应结束后，实时荧光定量PCR仪会自动给出PCR扩增的动力曲线(图1)及定量PCR的标准曲线,分别为107、106、105、104、103IU/ml(图2)。图2中标准曲线的斜率为-3.42，相关系数为0.999。

图1 PCR扩增的动力曲线

2.2 EB病毒感染与鼻咽癌与鼻咽癌患者临床参数的关系

112例鼻咽癌初诊患者中年龄最大的72岁，最小的21岁，40～49岁占34.82%(39/112)，其次为50～59岁占26.79%(30/112)。由表1可见，鼻咽癌初诊患者的年龄与EB病毒感染率有显著相关性(χ2=17.799P=0.001)。进行各年龄组两两比较，结果50～59岁组EB病毒阳性率明显高于60～69岁组，40～49岁组与60～69岁组比较(χ2=7.163P=0.007)、50～59岁与60～69岁组比较(矫正χ2=15.386P=0.0000)EB病毒的阳性率有统计学意义，见表1。

图2 PCR的标准曲线

男性鼻咽癌初治患者的EB病毒阳性率与女性相比无显著性差异(χ2=0.19,P=0.663)。

表1 鼻咽癌初诊患者年龄对EB病毒感染的影响/例

2.3 鼻咽癌初诊患者EB病毒阳性与其临床分期的关系

112例鼻咽癌初诊患者外周血EB病毒阳性率为74.11%(89/112)，其中强阳性16例(14.29%)，阳性47例(41.92%)，弱阳性20例(18.76%)。最高拷贝数为大于1×107，中位拷贝数为4.05×105。所有鼻咽癌初诊患者按照92分期标准进行了TNM分期(表2)。Ⅰ期与Ⅱ期，Ⅲ期与Ⅳ期鼻咽癌患者外周血EB病毒阳性率比较均无显著性差异，Ⅰ期与Ⅲ期(Fisher's Exact TestP=0.0013)、Ⅰ期与Ⅳ期(Fisher's Exact TestP=0.002)、Ⅱ期与Ⅲ期(矫正χ2= 6.973,P=0.008)、Ⅱ期与Ⅳ期(矫正χ2=7.285,P=0.007)比较均有显著性差异。将Ⅰ期和Ⅱ期归类为早期鼻咽癌，Ⅲ期和Ⅳ期归类为晚期鼻咽癌，经过卡方检验，发现Ⅲ期和Ⅳ期外周血EB病毒阳性率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期(矫正χ2=17.56,P=0.000)。对鼻咽癌患者临床TNM分期与外周血EB病毒含量做Spearman相关秩和检验(γ=0.345,P=0.000)，结果说明鼻咽癌患者TNM分期与外周血EB病毒含量呈正相关关系。

表2 不同临床分期鼻咽癌患者外周血EB病毒 DNA水平

3 讨论

荧光定量 PCR技术是近年来新兴的分子诊断方法。它具有常规PCR的高灵敏性，克服了常规PCR 技术不能定量以及易污染的问题。荧光定量 PCR技术运用了荧光探针，可以直接探测到PCR扩增过程中荧光信号的变化，实现了实时定量。

我们应用荧光定量PCR技术检测江西省内鼻咽癌初治患者血浆中EB病毒DNA，结果显示鼻咽癌患者的阳性率为74.11%。Lo[3]运用荧光定量PCR方法检测了57例鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA，55例为阳性，阳性率96%。Shotelersuk[4]运用巢式PCR方法检测167例鼻咽癌患者，87例为阳性，阳性率为52.1%。产生这种差异的可能原因为入组患者分期比例不同，使用的检测方法不同，不同地区鼻咽癌患者EB病毒感染特征不同有关。

本研究结果显示，EBV DNA阳性率男女之间无显著性差异。30岁到60岁三个年龄组之间EB病毒DNA无显著性差异，40～岁组与60～岁组EB病毒的阳性率比较时P值接近检验水准，50～岁组EB病毒的阳性率明显高于60～岁组。文献报道在鼻咽癌高发地区健康人群中EBV DNA感染与性别、年龄之间无相关关系。我们的研究结果显示鼻咽癌患者血浆中EB病毒DNA年龄分布特征与鼻咽癌的人群年龄分布(20～40岁开始上升，40～60岁达到发病高峰)很相似，这也提示EB病毒感染与鼻咽癌的发生有密切关系，EB病毒感染是鼻咽癌发生的高危因素。究竟EB病毒感染在鼻咽癌发生中起了多少作用，EB病毒感染是从幼年开始，鼻咽癌发病是成年以后，在这漫长的过程中EB病毒是怎样导致鼻咽癌发生的还有待于进一步研究。

本研究中分析了鼻咽癌患者血浆中 EBV DNA的含量与鼻咽癌分期的关系，结果显示，血浆中EBV DNA与鼻咽癌患者临床分期呈正相关关系，晚期鼻咽癌的EB 病毒含量明显高于早期鼻咽癌患者。EB病毒在宿主细胞中有两种存在方式，EB病毒或插入宿主细胞染色体中或以环状分子游离于细胞DNA之外。鼻咽癌病人肿瘤细胞来源的EB病毒DNA释放入血的机制目前尚不十分清楚。Chan等[5]研究发现血浆中EBV DNA不是完整的病毒颗粒而是裸露的DNA片断，故推测血浆EBV DNA是由坏死的肿瘤细胞释放入外周血。有学者认为鼻咽癌患者血清EBV DNA水平与肿瘤组织细胞凋亡有正相关性，提示外周血游离的EB病毒DNA是凋亡的肿瘤细胞释放的。买世娟报道早期和晚期患者的外周血单个核细胞EB病毒阳性率分别为76.19%(16/21)和73.42%(58/79)，无明显差异，但血清/血浆EB病毒阳性率分别为61.9%(13/21)和88.61%(70/79)，有明显差异，提示血清/血浆中检测到的EB病毒DNA是来源于肿瘤组织，并与局部肿瘤负荷有关。我们的研究结果说明随着鼻咽癌的进展(肿瘤体积的增大或肿瘤转移)血浆中 EBV DNA的阳性率亦增高，血清/血浆中检出的游离的EB病毒DNA可能来源于含有EB病毒的肿瘤细胞或单核/巨噬细胞破裂而释放病毒进入血循环。

综上所述血浆中EBV DNA水平增高与鼻咽癌临床分期、肿瘤负荷及病情相关。血浆EB 病毒 DNA定量检测可作为鼻咽癌诊断的手段之一。

[1] 蒋卫红，赵素萍，尹志华，等.定量和定位检测EB病毒在鼻咽癌组织中的感染状态〔J〕.癌症,2005,24(7):796-800.

[2] Mutirangura A,Pornthanakasem W,Theamboonlers A,et al.Epstein-Barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,1998,4(3):665-669.

[3] Lo YM,Chan LY,Lo KW,et al.Quantitative analysis of cell-free Epstein barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma 〔J〕.Cancer Res,1999,59(6):1188-1191.

[4] Shotelersuk K,Khorprasert C,Sakdikul S,et al.Epstein-Barr Virus DNA in Serum/Plasma as a Tumor Marker for Nasopharyngeal Cancer 〔J〕.Clin Cancer Res,2000,6(3):1046-1051.

[5] Chan KC,Zhang J,Chan AT,et al.Molecular characterization of circulating EBV DNA in the plasma of nasopharyngeal carcinoma and lymphoma patients 〔J〕.Cancer Res,2003,63(9):2028-2032.

(编辑：吴小红)

Detection of EB Virus in Plasma in the Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma

CHENWenxue,ZOUXuesen,LIJingao,etal.

JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To explore the diagnostic value of Epstein-Barr virus (EBV) DNA in plasma in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods Real time quantitative PCR was used to detect EBV DNA in plasma of 112 cases of first diagnosed nasopharyngeal carcinoma.Results EBV DNA positive rate of NPC had no correlation with gender.The EBV DNA positive rates of patients from 30 to 60 years old were higher than those of patients over 60(P<0.05).EBV DNA positive rate in NPC plasma was 74.11%.With the increase of NPC clinical stage,the EBV DNA positive rate increased.Conclusion The EBV DNA level of plasma and NPC clinical stage has a positive relationship.Detection of plasma EBV DNA is useful for the diagnosis of NPC.

Nasopharyngeal carcinoma (NPC);Epstein-Barr virus (EBV);DNA

330029 江西省肿瘤医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.005

R739.62

A

1001-5930(2014)12-1526-03

2014-08-21

2014-09-28)