鞣花酸抑制黑素细胞黑素合成及黑素传递的实验研究*

刘 栋 潘小钢 李雅琳 张峻岭 马慧军

鞣花酸抑制黑素细胞黑素合成及黑素传递的实验研究*

刘 栋1潘小钢1李雅琳1张峻岭1马慧军2△

目的观察鞣花酸对黑素细胞（melanocyte,MC）合成黑素以及传递黑素的影响并探讨其机制。方法分别纯化培养来自人包皮的表皮黑素细胞和角质形成细胞(keratinocyte,KC)，传第2代后以1∶10的比例将两细胞接种到3 cm×3 cm的小培养皿中，单独或混合培养的细胞经高、中、低（100、10、1 mg/L）3种浓度的鞣花酸干预48 h后，分别检测干预前后黑素细胞中黑素含量、酪氨酸酶活性的变化，采用流式法检测混合培养细胞中黑素传递的情况，以10 nmol/L熊果苷为阳性对照。结果3种浓度鞣花酸浓度均可下调细胞酪氨酸酶活性，并呈浓度依赖性。除了1 mg/L的鞣花酸对黑素细胞黑素合成无明显作用，其余浓度的鞣花酸均可降低黑素含量。鞣花酸同时具有抑制黑素传递的作用。结论鞣花酸可抑制黑素合成及黑素传递，或可作为一种皮肤美白剂应用。

鞣花酸；黑素细胞；一元酚单氧酶；角蛋白细胞

鞣花酸最早提取自南美的塔拉树，是一种天然植物精华，具有较强的抗氧化活性，目前其主要来源于草莓和绿茶。有临床资料显示外用鞣花酸对黄褐斑治疗有效，但具体的作用机制不明[1]。本研究以不同浓度的鞣花酸干预体外培养的人表皮黑素细胞（melanocyte,MC）和角质形成细胞(keratinocyte,KC)，观察黑素细胞酪氨酸酶活性、黑素含量以及处理前后黑素传递的情况，旨在研究鞣花酸治疗黄褐斑的深层药理机制，为更好地开发和利用抗黑素产品提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 鞣花酸、左旋多巴(L-dopa)、二甲基亚砜(DMSO)、分离酶(dispase)、霍乱毒素(CT)、佛波酯（TPA）、MCDB153培养基均购自美国Sigma公司，脱氧胆酸钠(美国Amersco公司)，角质形成细胞无血清培养基（keratinocyte serum free medium,K-SFM）为美国Gibco公司产品，兔抗人多克隆广谱角蛋白抗体、鼠抗人单克隆NKI/beteb抗体、FITC交联的羊抗鼠IgG、PE交联的驴抗兔IgG抗体（美国abcam公司），25 cm2塑料培养瓶(美国Corning公司)，胎牛血清(海克隆生物化学制品有限公司)，高速冷冻离心机、722分光光度计(上海精密分析仪器有限公司），Clinibio128c酶联免疫检测仪（澳大利亚Clinibio公司）。FACSAriaⅡ分选型流式细胞仪（美国BD公司）

1.2 细胞培养

1.2.1 MC和KC的纯化和培养 取包皮环切手术患者的包皮标本，去除皮下组织后剪成1 cm×1 cm的小片，0.25%分离酶4℃放置12～16 h，眼科镊轻轻分离表真皮，用0.25%的胰酶37℃消化表皮5～10 min，用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素，0.05 mg/L CT，50 nmol/L TPA的MCDB153培养基于37℃、5%CO2条件下常规培养，取传2代的纯化的表皮黑素细胞（经HMB45单抗免疫组化和fontanamasson染色证实），待生长至融合状态，以0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化，台盼蓝染色法计数活细胞数，然后接种至25 cm2塑料培养瓶，浓度为1×105个/cm2，液体量5 mL/瓶。细胞接种12 h后，用含药物的新鲜培养液换液1次，继续孵育72 h后收获细胞并计数，参照文献[2]的方法测定酪氨酸酶活性和黑素含量。

1.2.2 表皮MC与KC共培养 将已纯化的表皮MC消化离心后与纯化培养的KC以1∶10的比例贴壁培养于3 cm×3 cm的小培养皿中，添加K-SFM培养基混合培养，3 d换液1次，用100 nmol/L α-黑色素细胞雌激素（α-MSH）干预细胞3 d，未添加药物的培养基作为空白对照，倒置显微镜下观察共培养细胞生长及形态学变化，用于黑素传递的测试。

1.3 实验分组 鞣花酸贮液用MCDB153配制成浓度为10 g/L的母液，-20℃保存，临用时用新鲜培养基调至终浓度，其实验浓度为1、10、100 mg/L，观察24、72 h时的指标变化。空白对照组仅加入相应溶媒，每一处理因素重复测定4次。

1.4 流式细胞仪检测黑素传递 参考文献[3]，共培养细胞接种至底面积为25 cm2的培养瓶后，分别加入含有1、10、100 mg/L 3个浓度梯度鞣花酸的培养液各3 mL，空白对照组仅加入培养液和相应溶媒，共培养24 h后分别用抗鼠抗人角蛋白（1∶200）和NKI/beteb（1∶200）单克隆抗体，37 ℃孵育2 h，加入羊抗鼠的免疫荧光抗体IgG（1∶500稀释），37℃孵育20 min后上流式细胞仪检测。每一处理因素重复测量3次。以发生传递的KC占总KC的百分比表示黑素传递量。

1.5 统计学方法 使用SPSS 10.0统计软件分析，数据以xˉ±s表示，采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的鞣花酸对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响 见表1。3种浓度鞣花酸浓度均可下调细胞酪氨酸酶活性，并呈浓度依赖性。除1 mg/L的鞣花酸对黑素细胞黑素合成无明显作用，其余浓度的鞣花酸均可降低黑素含量。

2.2 鞣花酸对黑素传递的影响 鞣花酸在1 mg/L即显示有抑制黑素传递作用，与空白对照组相差异比有统计学意义，随浓度增加其抑制作用亦增加，见图1、2。

Table 1 Effects of ellagic acid on melanogenesis of human epidermal melanocytes表1 鞣花酸对表皮黑素细胞酪氨酸酶活性、黑素含量的影响 （n=4±s）

Table 1 Effects of ellagic acid on melanogenesis of human epidermal melanocytes表1 鞣花酸对表皮黑素细胞酪氨酸酶活性、黑素含量的影响 （n=4±s）

＊＊P＜0.01；a与空白对照组（0 mg/L）比较,P ＜ 0.05

鞣花酸浓度（mg/L）011 0 100 F酪氨酸酶活性24 h 325.26±34.12 254.58±27.30a229.23±21.25a153.45±17.96a102.73＊＊72 h 378.39±41.24 275.98±32.47a257.35±14.89a178.57±12.67a126.49＊＊黑素含量24 h 331.57±47.64 356.16±32.15 312.48±25.79a225.56±19.45a102.65＊＊72 h 410.72±48.16 397.63±40.56 322.66±35.29a256.43±23.22a98.07＊＊

Figure1 Flow cytometry analysis of the effect of ellagic acid on melanin transfer in co-cultured human melanocytes and keratinocytes图1 不同剂量鞣花酸对混合培养细胞黑素传递的流式细胞图

Figure 2 Effects of ellagic acid on melanin transfer图2 不同浓度鞣花酸对黑素传递的影响

3 讨论

皮肤颜色主要受色素沉着的影响，色素沉着是表皮内KC和MC相互作用的共同结果。此过程包括4个连续的步骤：（1）黑素小体在MC内的装配与黑素合成。（2）黑素小体从MC核周向树突远端转移。（3）黑素小体传递至邻近KC。（4）黑素小体在KC内再分布、降解[4]。研究证实，皮肤色素沉着主要依赖于MC合成黑素以及黑素小体向周围KC传递的能力大小。

鞣花酸又称没食子酸、胡颓子酸，是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚成分。20世纪50年代，国外已经开始对鞣花酸进行研究，80年代国外已将其应用于临床试验阶段。近十年来，由于发现了鞣花酸的抗突变、抗癌效应以及其可以作为美白剂而引起了人们更大的关注。对鞣花酸的生理作用及其机制的研究也越来越受到重视。既往有研究发现鞣花酸体外可抑制黑素细胞中酪氨酸酶的活性以及阻断黑素生成[5]。临床显示外用鞣花酸具有与熊果苷类似的美白作用[1]。本研究发现：1 mg/L鞣花酸即具有一定的黑素合成抑制作用，且随着浓度的增加其作用有增加的趋势，即可呈浓度依赖性地减少黑素细胞黑素含量及酪氨酸酶活性。因此，鞣花酸可作为一种潜在的安全有效的美白剂，其美白作用与抑制黑素细胞合成黑素以及抑制黑素小体从黑素细胞向角质形成细胞的传递有关。

[1] Ertam I,Mutlu B,Unal I,et al.Efficiency of ellagic acid and arbutin in melasma:a randomized,prospective,open-label study[J].J Dermatol,2008,35(9):570-574.

[2]刘栋,朱文元,谭城.糖皮质激素对培养Cloudman S91黑素瘤细胞黑素合成的影响[J].临床皮肤科杂志,2002,32(1):3-6.

[3]Ma HJ,Zhao G,Zi SX,et al.Efficacy of quantifying melanosome transfer with flow cytometry in a human melanocyte-HaCaT keratinocyte co-culture system in vitro[J].Exp Dermatol,2010,19(8):e282-285.

[4]廖非,刘栋,徐丽敏.黑素小体转运机制的研究进展[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2009,8(2):125-127.

[5]Shimogaki H,Tanaka Y,Tamai H,et al.In vitro and in vivo evaluation of ellagic acid on melanogenesis inhibition[J].Int J Cosmet Sci,2000,22(4):291-303.

（2013-06-15收稿 2013-10-28修回）

（本文编辑 闫娟）

Effects of Ellagic Acid on Melanogenesis and Melansome Transfer

LIU Dong1,PAN Xiaogang1,LI Yalin1,ZHANG Junling1,MA Huijun2
1 Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Tianjin Traditional Chinese Medicine Research Institute,Tianjin 300021,China;2 Department of Dermatology,The 309 Hospital of Chinese People’s Liberation Army

ObjectiveTo investigate the effect of ellagic acid on human epidermal melanocyte melanogenesis and melanin transfer,and the mechanism thereof.MethodsThe human melanocytes and and keratinocytes were co-cultured and purified.After passing the second generation,cells of 1∶10 ratio were inoculated into the small dish(3 cm × 3 cm).The changes of melanin content and tyrosinase activity in melanocytes were detected before and after intervention with ellagic acid(100,10 and 1 mg/L)for 48 h.The melanin transfer in cultured cells was detected by flow cytometry method.The 10 nmol/L arbutin was used as the positive control.ResultsThe tyrosinase activity was down-regulated by ellagic acid in a dose-dependent manner.The ellagic acid can reduce the melanin content except for the 1 mg/L of ellagic acid.The melanin transfer was also inhibited by ellagic acid in a dose-dependence manner.ConclusionEllagic acid can be used for skinwhitening cosmetic and the depigmenting effect might be due to the down-regulation of melanogenesis and melanin transfer.

ellagic acid；melanocytes；monophenol monooxygenase；keratinocytes

R751 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.005

*天津市卫生局科技基金（项目编号：06KY01）;广州宝洁有限公司（P&G）科技基金

1天津市中医药研究院附属医院皮肤科（邮编300021）；2北京,解放军第309医院皮肤科

△通讯作者 E-mail:melanocytes@163.com