MicroRNA-21在卵巢癌中的表达及其与临床病理因素之间的关系

赵乐+杨国栋

[摘要] 目的 检测卵巢癌组织中microRNA-21基因的表达，并探讨其与临床病理因素间的关系。 方法 采用实时定量PCR方法检测64例卵巢癌组织和30例正常卵巢组织中microRNA-21的相对表达量，并分析microRNA-21的表达量在不同临床病理因素间的差异。 结果 在正常卵巢组织、卵巢癌组织中microRNA-21的相对表达量分别为4.23±1.02、7.64±0.87，其差异具有统计学意义（P<0.05）；无淋巴结转移组与有淋巴转移组的相对表达量分别为4.99±1.02，7.24±0.91，其差异有统计学意义（P<0.05）；临床分期为0～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的卵巢癌组织中microRNA-21的相对表达量分别为4.42±0.82、7.75±1.13，其差异有统计学意义（P<0.05），但microRNA-21在卵巢癌组织中的表达与患者年龄、临床病理分型无关，其差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 microRNA-21的表达量在卵巢癌组织中较正常卵巢组织显著增加，其异常高表达可能与卵巢癌的发生、发展有关。

[关键词] MicroRNA-21；卵巢癌；qRT-PCR

[中图分类号] R737.31[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（b）-0050-03

Expression of MicroRNA-21 in ovarian cancer and its relationship with clinical pathological factors

ZHAO Le1 YANG Guo-dong2

1.Department of Clinical Laboratory,the First Hospital Affiliated to Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Department of Vascular Surgery,the First Hospital Affiliated to Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China

[Abstract] Objective To detect the expression of microRNA-21 gene in ovarian cancer issue,and to explore its relationship with clinical pathological factors. Methods The relative expression amount of microRNA-21 of ovarian cancer tissue in 64 cases and normal ovarian tissue in 30 cases was detected by quantitative real-time PCR,and the difference of the expression amount of microRNA-21 in different clinical pathological factors. Results The relative expression amount of MicroR-21 in normal ovarian tissue and ovarian cancer tissue was 4.23±1.02 and 7.64±0.87 respectively,and there was a statistical difference between the two (P＜0.05);the relative expression amount of the ymph node metastasis group and the lymph node metastasis group was 7.24±0.91 and 4.99±1.02 respectively,and there was a statistical difference between the two groups (P＜0.05);the relative expression amount of microRNA-21 of ovarian cancer tissue 0-Ⅱstage and Ⅲ-Ⅳ stage of clinical stage was4.42±0.82, 7.75±1.13 respectively,and there was a statistical difference between the two(P<0.05).However,microRNA-21 expression was not significantly correlated with the patients′ age and pathological types (P>0.05). Conclusion The expression of microRNA-21 is higher in ovarian cancer tissue compared to normal ovarian tissue,the abnomal high expression of microRNA-21 may be associated with carcinogenesis and development of ovarian cancer.

[Key words] MicroRNA-21;Ovarian cancer;Quantitative real-time PCR

卵巢癌是严重威胁我国妇女健康的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。微小RNA（microRNAs）是一类内源性的小分子RNA，在高等生物的生长发育过程中起重要的调节作用。microRNA-21是miRNAs中的一员，现阶段研究显示，microRNA-21在人类多种肿瘤中呈高表达，并参与了细胞的增殖、分化及凋亡过程，且与肿瘤的生长、侵袭、转移等密切相关，但是，microRNA-21在卵巢癌中的表达情况报道很少，本实验拟通过检测microRNA-21在卵巢正常组织及卵巢癌组织中的表达情况，探讨microRNA-21在卵巢癌发生、发展过程中的作用，以期有助于卵巢癌发生机制的研究。

1 资料与方法

1.1一般资料

收集河南科技大学第一附属医院2012年10月~2013年11月手术切除的卵巢癌新鲜组织标本64例，年龄45～62岁，中位年龄52.3岁。临床分期0～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期19例；有淋巴转移者39例，无淋巴转移者25例。同时收集同一患者远端正常卵巢组织30例，均经病理证实，且患者术前未接受过放化疗。所有标本在离体0.5 h内迅速保存于液氮中备用。

1.2 主要试剂及仪器

DNA marker、RNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒（日本TaKaRa公司），GS-15R台式低温高速离心机（美国Beckman公司），PCR扩增仪（德国Biometra公司），Light cycler1.5荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）。

1.3 引物设计

microRNA-21引物序列，上游：5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′；下游，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。内参为U6引物序列，上游： 5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-AAAAT-3′；下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。以上引物均由上海生工公司合成。

1.4 卵巢组织microRNA-21的提取及qRT-PCR

严格按照RNA提取试剂盒的操作说明提取总RNA，用紫外分光光度计测量RNA A值，选取A 260 nm/280 nm比值在1.8~2.0的样本进行进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板，严格按照qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，反应参数为94℃ 4 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，40个循环。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 18.0进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 microRNA-21在正常卵巢组织及卵巢癌中相对表达量的比较

正常卵巢组织中microRNA-21的相对表达量为4.23±1.02，明显低于卵巢癌组织的7.64±0.87（t=2.306，P<0.05）。

2.2 microRNA-21的表达与临床病理因素间的关系

临床分期0～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的卵巢癌组织中microRNA-21的相对表达量分别为4.42±0.82、7.75±1.13，其差异有统计学意义（t=1.962，P<0.05）；无淋巴结转移组与有淋巴转移组的相对表达量分别为4.99±1.02、7.24±0.91，其差异有统计学意义（t=1.648，P<0.05）；但microRNA-21在卵巢癌组织中的表达与患者的年龄、临床病理分型无关，其差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 卵巢癌组织中microRNA-21的表达与临床病理因素间的关系

3 讨论

miRNA是由19～22个核苷酸组成的一类单链非编码RNA，通过与mRNA的3′端结合，降解或抑制mRNA的翻译，可调控人体大约30%的mRNA[1]。近年来的重多研究发现，miRNA可通过与mRNA的作用，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、转移等过程[2-3]。Lagos-Quintana等[4]于2001年证实，在脊椎动物和非脊椎动物中存在类似于Lin-4和Let-7的miRNA，其中一种即为microRNA-21，microRNA-21位于染色体17q23.2 FRA17B的脆性区域，其含有22个核苷酸。大量的文献报道证实，microRNA-21是一种癌基因，通过调控NFIB、PDCD4、PTEN、SPRY2等抑癌基因，在多种肿瘤组织中呈异常高表达[5-7]。本实验通过qRT-PCR的方法检测了microRNA-21在正常卵巢组织及卵巢癌组织中的相对表达量，研究发现，在正常卵巢组织中的microRNA-21的相对表达量为0.237±0.021，明显低于卵巢癌组织中的0.646±0.027（P<0.05），由此可以推测microRNA-21可能在卵巢癌的发生、发展过程中起推动作用，microRNA-21的激活可能导致卵巢癌的发生、发展，这与microRNA-21在其他肿瘤组织中的研究结果相似。Schetter等[8-10]研究发现 microRNA-21在结直肠癌中的表达明显高于其邻近正常组织。Matsushima等[11]在食管癌中的研究发现，食管癌组织中的microRNA-21的表达均较正常组织显著上调，且鳞癌组织中microRNA-21的表达量升高与预后不良有明显关系。进一步研究发现，microRNA-21的表达量与患者的年龄、病理学分型无关（P＞0.05），但随着肿瘤分化程度的降低及淋巴结的转移，microRNA-21的表达量明显升高，提示microRNA-21可能在卵巢癌肿瘤细胞的浸润及转移过程中发挥一定的作用，并在一定程度上调控卵巢癌细胞的行为。

综上所述，本实验证实了microRNA-21在卵巢癌组织中呈异常高表达，这一发现可能对卵巢癌的治疗和预后具有重要意义，但目前对microRNA-21转录调控的作用机制尚不明确，尚需进行后续研究。

[参考文献]

[1]Wu Y，Fu X，Zhu X，et al.Prognostic role of systemic inflammatory response in renal cell carcinoma:a systematic review and meta-analysis[J].J Cancer Res Clin Oncol，2011， 137（5）：887-896.

[2]Wang B，Zhang Q.The expression and clinical significance of circulating microRNA-21 in serum of five solid tumors[J].J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（10）：1659-1666．

[3]Liu M， Tang Q， Qiu M， et al.MiR-21 targets the tumor suppressor RhoB and regulates proliferation,invasion and apoptosis in colorectal cancer cells[J].FEBS Lett，2011，585（19）：2998-3005.

[4]Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science，2001，294（5543）：853-858.

[5]Iliopoulos D，Jaeger SA，Hirsch HA，et al.STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer[J].Mol Cell，2010，39（4）：493-506.

[6]Yang CH，Yue J，Fan M，et al.IFN induces miR-21 through a signal transducer and activator of transcription 3-dependent pathway as a suppressive negative feedback on IFN-induced apoptosis[J].Cancer Res，2010，70（20）：8108-8116.

[7]Braun J，Hoang-Vu C，Dralle H，et al.Downregulation of microRNAs directs the EMT and invasive potential of anaplastic thyroid carcinomas[J].Oncogene，2010，29（29）：4237-4244.

[8]Schetter AJ，Leung SY，Sohn JJ，et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J].JAMA，2008，299（4）：425-436.

[9]Chang KH，Miller N，Kheirelseid EA，et al.MicroRNA-21 and PDCD4 expression in colorectal cancer[J].Eur J Surg Oncol，2011，37（7）：597-603.

[10]Ma Y，Zhang P，Yang J，et al.Candidate microRNA biomarkers in human colorectal cancer:systematic review profiling studies and experimental validation[J].Int J Cancer，2012，130（9）：2077-2087.

[11]Matsushima L，Isomoto H，Kohno S，et al.MicroRNAs and esophageal squamous cell carcinoma[J].Digestion，2010， 82（3）：138-144.

（收稿日期：2014-04-01本文编辑：许俊琴）

1.3 引物设计

microRNA-21引物序列，上游：5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′；下游，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。内参为U6引物序列，上游： 5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-AAAAT-3′；下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。以上引物均由上海生工公司合成。

1.4 卵巢组织microRNA-21的提取及qRT-PCR

严格按照RNA提取试剂盒的操作说明提取总RNA，用紫外分光光度计测量RNA A值，选取A 260 nm/280 nm比值在1.8~2.0的样本进行进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板，严格按照qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，反应参数为94℃ 4 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，40个循环。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 18.0进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 microRNA-21在正常卵巢组织及卵巢癌中相对表达量的比较

正常卵巢组织中microRNA-21的相对表达量为4.23±1.02，明显低于卵巢癌组织的7.64±0.87（t=2.306，P<0.05）。

2.2 microRNA-21的表达与临床病理因素间的关系

临床分期0～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的卵巢癌组织中microRNA-21的相对表达量分别为4.42±0.82、7.75±1.13，其差异有统计学意义（t=1.962，P<0.05）；无淋巴结转移组与有淋巴转移组的相对表达量分别为4.99±1.02、7.24±0.91，其差异有统计学意义（t=1.648，P<0.05）；但microRNA-21在卵巢癌组织中的表达与患者的年龄、临床病理分型无关，其差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 卵巢癌组织中microRNA-21的表达与临床病理因素间的关系

3 讨论

miRNA是由19～22个核苷酸组成的一类单链非编码RNA，通过与mRNA的3′端结合，降解或抑制mRNA的翻译，可调控人体大约30%的mRNA[1]。近年来的重多研究发现，miRNA可通过与mRNA的作用，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、转移等过程[2-3]。Lagos-Quintana等[4]于2001年证实，在脊椎动物和非脊椎动物中存在类似于Lin-4和Let-7的miRNA，其中一种即为microRNA-21，microRNA-21位于染色体17q23.2 FRA17B的脆性区域，其含有22个核苷酸。大量的文献报道证实，microRNA-21是一种癌基因，通过调控NFIB、PDCD4、PTEN、SPRY2等抑癌基因，在多种肿瘤组织中呈异常高表达[5-7]。本实验通过qRT-PCR的方法检测了microRNA-21在正常卵巢组织及卵巢癌组织中的相对表达量，研究发现，在正常卵巢组织中的microRNA-21的相对表达量为0.237±0.021，明显低于卵巢癌组织中的0.646±0.027（P<0.05），由此可以推测microRNA-21可能在卵巢癌的发生、发展过程中起推动作用，microRNA-21的激活可能导致卵巢癌的发生、发展，这与microRNA-21在其他肿瘤组织中的研究结果相似。Schetter等[8-10]研究发现 microRNA-21在结直肠癌中的表达明显高于其邻近正常组织。Matsushima等[11]在食管癌中的研究发现，食管癌组织中的microRNA-21的表达均较正常组织显著上调，且鳞癌组织中microRNA-21的表达量升高与预后不良有明显关系。进一步研究发现，microRNA-21的表达量与患者的年龄、病理学分型无关（P＞0.05），但随着肿瘤分化程度的降低及淋巴结的转移，microRNA-21的表达量明显升高，提示microRNA-21可能在卵巢癌肿瘤细胞的浸润及转移过程中发挥一定的作用，并在一定程度上调控卵巢癌细胞的行为。

综上所述，本实验证实了microRNA-21在卵巢癌组织中呈异常高表达，这一发现可能对卵巢癌的治疗和预后具有重要意义，但目前对microRNA-21转录调控的作用机制尚不明确，尚需进行后续研究。

[参考文献]

[1]Wu Y，Fu X，Zhu X，et al.Prognostic role of systemic inflammatory response in renal cell carcinoma:a systematic review and meta-analysis[J].J Cancer Res Clin Oncol，2011， 137（5）：887-896.

[2]Wang B，Zhang Q.The expression and clinical significance of circulating microRNA-21 in serum of five solid tumors[J].J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（10）：1659-1666．

[3]Liu M， Tang Q， Qiu M， et al.MiR-21 targets the tumor suppressor RhoB and regulates proliferation,invasion and apoptosis in colorectal cancer cells[J].FEBS Lett，2011，585（19）：2998-3005.

[4]Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science，2001，294（5543）：853-858.

[5]Iliopoulos D，Jaeger SA，Hirsch HA，et al.STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer[J].Mol Cell，2010，39（4）：493-506.

[6]Yang CH，Yue J，Fan M，et al.IFN induces miR-21 through a signal transducer and activator of transcription 3-dependent pathway as a suppressive negative feedback on IFN-induced apoptosis[J].Cancer Res，2010，70（20）：8108-8116.

[7]Braun J，Hoang-Vu C，Dralle H，et al.Downregulation of microRNAs directs the EMT and invasive potential of anaplastic thyroid carcinomas[J].Oncogene，2010，29（29）：4237-4244.

[8]Schetter AJ，Leung SY，Sohn JJ，et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J].JAMA，2008，299（4）：425-436.

[9]Chang KH，Miller N，Kheirelseid EA，et al.MicroRNA-21 and PDCD4 expression in colorectal cancer[J].Eur J Surg Oncol，2011，37（7）：597-603.

[10]Ma Y，Zhang P，Yang J，et al.Candidate microRNA biomarkers in human colorectal cancer:systematic review profiling studies and experimental validation[J].Int J Cancer，2012，130（9）：2077-2087.

[11]Matsushima L，Isomoto H，Kohno S，et al.MicroRNAs and esophageal squamous cell carcinoma[J].Digestion，2010， 82（3）：138-144.

（收稿日期：2014-04-01本文编辑：许俊琴）

1.3 引物设计

microRNA-21引物序列，上游：5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′；下游，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。内参为U6引物序列，上游： 5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-AAAAT-3′；下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。以上引物均由上海生工公司合成。

1.4 卵巢组织microRNA-21的提取及qRT-PCR

严格按照RNA提取试剂盒的操作说明提取总RNA，用紫外分光光度计测量RNA A值，选取A 260 nm/280 nm比值在1.8~2.0的样本进行进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板，严格按照qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，反应参数为94℃ 4 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，40个循环。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 18.0进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 microRNA-21在正常卵巢组织及卵巢癌中相对表达量的比较

正常卵巢组织中microRNA-21的相对表达量为4.23±1.02，明显低于卵巢癌组织的7.64±0.87（t=2.306，P<0.05）。

2.2 microRNA-21的表达与临床病理因素间的关系

临床分期0～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的卵巢癌组织中microRNA-21的相对表达量分别为4.42±0.82、7.75±1.13，其差异有统计学意义（t=1.962，P<0.05）；无淋巴结转移组与有淋巴转移组的相对表达量分别为4.99±1.02、7.24±0.91，其差异有统计学意义（t=1.648，P<0.05）；但microRNA-21在卵巢癌组织中的表达与患者的年龄、临床病理分型无关，其差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 卵巢癌组织中microRNA-21的表达与临床病理因素间的关系

3 讨论

miRNA是由19～22个核苷酸组成的一类单链非编码RNA，通过与mRNA的3′端结合，降解或抑制mRNA的翻译，可调控人体大约30%的mRNA[1]。近年来的重多研究发现，miRNA可通过与mRNA的作用，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、转移等过程[2-3]。Lagos-Quintana等[4]于2001年证实，在脊椎动物和非脊椎动物中存在类似于Lin-4和Let-7的miRNA，其中一种即为microRNA-21，microRNA-21位于染色体17q23.2 FRA17B的脆性区域，其含有22个核苷酸。大量的文献报道证实，microRNA-21是一种癌基因，通过调控NFIB、PDCD4、PTEN、SPRY2等抑癌基因，在多种肿瘤组织中呈异常高表达[5-7]。本实验通过qRT-PCR的方法检测了microRNA-21在正常卵巢组织及卵巢癌组织中的相对表达量，研究发现，在正常卵巢组织中的microRNA-21的相对表达量为0.237±0.021，明显低于卵巢癌组织中的0.646±0.027（P<0.05），由此可以推测microRNA-21可能在卵巢癌的发生、发展过程中起推动作用，microRNA-21的激活可能导致卵巢癌的发生、发展，这与microRNA-21在其他肿瘤组织中的研究结果相似。Schetter等[8-10]研究发现 microRNA-21在结直肠癌中的表达明显高于其邻近正常组织。Matsushima等[11]在食管癌中的研究发现，食管癌组织中的microRNA-21的表达均较正常组织显著上调，且鳞癌组织中microRNA-21的表达量升高与预后不良有明显关系。进一步研究发现，microRNA-21的表达量与患者的年龄、病理学分型无关（P＞0.05），但随着肿瘤分化程度的降低及淋巴结的转移，microRNA-21的表达量明显升高，提示microRNA-21可能在卵巢癌肿瘤细胞的浸润及转移过程中发挥一定的作用，并在一定程度上调控卵巢癌细胞的行为。

综上所述，本实验证实了microRNA-21在卵巢癌组织中呈异常高表达，这一发现可能对卵巢癌的治疗和预后具有重要意义，但目前对microRNA-21转录调控的作用机制尚不明确，尚需进行后续研究。

[参考文献]

[1]Wu Y，Fu X，Zhu X，et al.Prognostic role of systemic inflammatory response in renal cell carcinoma:a systematic review and meta-analysis[J].J Cancer Res Clin Oncol，2011， 137（5）：887-896.

[2]Wang B，Zhang Q.The expression and clinical significance of circulating microRNA-21 in serum of five solid tumors[J].J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（10）：1659-1666．

[3]Liu M， Tang Q， Qiu M， et al.MiR-21 targets the tumor suppressor RhoB and regulates proliferation,invasion and apoptosis in colorectal cancer cells[J].FEBS Lett，2011，585（19）：2998-3005.

[4]Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science，2001，294（5543）：853-858.

[5]Iliopoulos D，Jaeger SA，Hirsch HA，et al.STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer[J].Mol Cell，2010，39（4）：493-506.

[6]Yang CH，Yue J，Fan M，et al.IFN induces miR-21 through a signal transducer and activator of transcription 3-dependent pathway as a suppressive negative feedback on IFN-induced apoptosis[J].Cancer Res，2010，70（20）：8108-8116.

[7]Braun J，Hoang-Vu C，Dralle H，et al.Downregulation of microRNAs directs the EMT and invasive potential of anaplastic thyroid carcinomas[J].Oncogene，2010，29（29）：4237-4244.

[8]Schetter AJ，Leung SY，Sohn JJ，et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J].JAMA，2008，299（4）：425-436.

[9]Chang KH，Miller N，Kheirelseid EA，et al.MicroRNA-21 and PDCD4 expression in colorectal cancer[J].Eur J Surg Oncol，2011，37（7）：597-603.

[10]Ma Y，Zhang P，Yang J，et al.Candidate microRNA biomarkers in human colorectal cancer:systematic review profiling studies and experimental validation[J].Int J Cancer，2012，130（9）：2077-2087.

[11]Matsushima L，Isomoto H，Kohno S，et al.MicroRNAs and esophageal squamous cell carcinoma[J].Digestion，2010， 82（3）：138-144.

（收稿日期：2014-04-01本文编辑：许俊琴）