建立RQ-PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者6种不同PML／RARα异构体

韩兰秀，林江，徐昕，钱军，周剑波，王雅丽

（1.江苏大学附属人民医院血液科，江苏镇江212002；2.东南大学医学院附属江阴医院实验室，江苏江阴214400）

建立RQ-PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者6种不同PML／RARα异构体

韩兰秀1，2，林江1，徐昕2，钱军1，周剑波2，王雅丽1

（1.江苏大学附属人民医院血液科，江苏镇江212002；2.东南大学医学院附属江阴医院实验室，江苏江阴214400）

目的：建立检测急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）患者PML／RARα融合基因6种特异性异构体（bcr1／2、P4R3、P46R3、bcr3及P2R3）的实时定量PCR（RQ-PCR）技术，并评价其特异性。方法：设计不同异构体的特异性引物和探针，建立异构体特异性RQ-PCR方法对6种特异性异构体PML／RARα阳性模板进行扩增，评价异构体定量检测的特异性，并检测10例APL患者中不同异构体的含量。结果：所建立的各异构体特异性RQ-PCR法最大敏感性均达10拷贝／μL，但其重复性较差，108～102拷贝／μL阳性模板的重复性良好，正常对照及空白对照无扩增信号，每个异构体特异性RQ-PCR均不能扩增其他异构体。5例长型（bcr1）和1例变异型（bcr2）阳性APL患者中bcr1／2异构体表达量为7.71%～89.71%（中位数13.70%），P4R3异构体表达量为0.71%～16.26%（中位数4.48%），P46R3异构体表达量为3.57%～14.09%（中位数6.33%）。4例短型（bcr3）患者中bcr3异构体表达量为21.43%～197.04%（中位数100.69%），P2R3异构体表达量为0.34%～9.07%（中位数2.45%）。1例短型患者经诱导治疗缓解后bcr3和P2R3异构体转录本明显下降，复发时又明显升高。结论：检测PML／RARα异构体特异性RQ-PCR方法敏感、可靠，可用于APL患者不同异构体的定量检测和微小残留病灶的随访监测。

聚合酶链反应；急性早幼粒细胞白血病；PML／RARα；异构体

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓系白血病中的一个特殊亚型，约占10%。90%以上APL患者具有特征性的染色体易位t（15；17）（q22；q12-21），导致融合基因PML／RARα形成，编码PML／RARα融合蛋白，从而导致粒细胞发育受阻于早幼粒细胞阶段。根据PML基因断裂位点的改变，主要产生3种不同的异构体融合基因：长型（bcr1）、短型（bcr3）和变异型（bcr2）。Pandolfi等［1］在1992年即发现长型和变异型PML／RARα阳性的患者中同时存在PML外显子4和RARα外显子3重排（P4R3），导致终止密码子在RARα外显子3中提前出现，可能编码一个异常的截断PML蛋白，短型患者同时存在PML外显子2和RARα外显子3重排（P2R3），也导致终止密码子在RARα外显子3中提前出现，其后国内外一直未有相关研究。目前APL患者中不同PML／RARα异构体共表达的临床意义不明。我们同时设计了bcr1／2、P4R3、P46R3、bcr3和P2R3等6种转录本的特异性引物，建立了异构体特异性实时定量PCR（RQ-PCR）检测方法，并对10例APL患者的冻存样本进行了检测，证明了该方法的可行性。

1 对象与方法

1.1 标本来源

10例初诊APL患者均为本院住院病例，诊断按文献［2］，染色体核型分析均为t（15；17）阳性，且均经RQ-PCR［3］验证。其中5例患者为长型PML／RARα阳性，1例患者为变异型PML／RARα阳性，4例为短型PML／RARα阳性。阳性对照选用NB4细胞株，正常对照取自血常规正常的10例胸外科肿瘤患者的肋骨骨髓。

1.2 细胞分离、RNA提取及反转录

每例患者均于初诊时抽取肝素抗凝骨髓标本2 mL，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），Trizol一步法提取总RNA，经紫外分光光度仪定量，取RNA 2.0μg应用6随机引物反转录合成第1链cDNA，反应体系为40μL，含MMLV反转录酶200 U、dNTP（每种0.5 mmol／L）、10 mmol／L DTT、25 U RNA酶抑制剂，于37℃反转录1 h、95℃5 min灭活，cDNA储存于－20℃备用。

1.3 RQ-PCR引物、探针的合成及阳性模板的制备

利用Primer 5.0软件设计特异性异构体的上游引物，其中bcr1／2的上游引物设计在PML第5外显子上，可以同时扩增bcr1和bcr2异构体转录本，共用下游引物和探针来自“欧洲抗癌计划”［4］。引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成。见表1。

表1 不同PM L／RARα异构体特异性RQ-PCR的引物和探针序列

分别应用5种异构体特异性RQ-PCR扩增长型和短型APL患者的cDNA标本，得到相应的扩增产物。将扩增产物纯化，连接到PGEM-T载体（美国Promega公司），再转入DH5α感受态中。利用蓝白斑筛选挑取白色阳性菌落克隆，经上海基康生物技术公司测序鉴定后进行质粒抽提、定量，最后从108拷贝／μL开始进行10倍稀释建立阳性模板梯度，置于4℃储存备用。

1.4 RQ-PCR检测患者PML／RARα融合基因异构体含量

PCR反应体系为25μL，含10×缓冲液2.5μL、MgCl24.0 mmol／L、dNTPs 0.2 mmol／L、引物0.5 μmol／L、探针0.2μmol／L、Taq酶1.0 U、50×ROX 0.5μL和cDNA 50 ng。反应在7300扩增仪（ABI公司）上进行，95℃预变性5min，然后94℃15 s、60℃1 min，共45个循环。扩增仪利用电荷偶联装置（CCD）照相机每隔7秒实时检测一次释出的荧光信号，最后应用SDS 1.4软件进行数据分析。为了保证检测结果的特异性和可信性，该RQ-PCR方法检测患者cDNA时均附带了不同浓度的阳性模板cDNA，正常对照cDNA和空白对照（NTC）。应用看家基因ABL作为内参照［3］。PML／RARα转录本的绝对量表示为每50 ng总RNA中含有的拷贝数，而每个患者中PML／RARα转录本的值则以相对量表示（NPML／RARα＝PML／RARα转录本的拷贝数／ABL拷贝数×100%）。

1.5 不同异构体定量检测的特异性评价

用每种特异性异构体RQ-PCR反应体系扩增其他异构体的阳性模板，评价异构体间定量检测的特异性。

1.6 统计学处理

应用SPSS 10.0软件包进行相关中位数统计处理。不同浓度PML／RARα融合基因异构体重复6次的检测结果采用±s表示。

2 结果

2.1 RQ-PCR方法的敏感性、重复性、特异性

应用不同浓度质粒标准品所建立的5组标准曲线（图1）均达到了良好的敏感性、重复性和特异性。最大敏感度均达到10拷贝／μL，但10拷贝／μL的重复性不好，而108～102拷贝／μL重复性良好（表2）。10例正常对照及空白对照无任何阳性信号扩增。标准曲线的相关参数见表3。

图1 不同浓度PM L／RARα异构体重组质粒RQ-PCR的荧光扩增结果及其标准曲线

表2 不同浓度PML／RARα融合基因异构体检测结果

表3 PM L／RARα融合基因异构体标准曲线的相关系数

2.2 不同异构体RQ-PCR定量检测的特异性

每个异构体RQ-PCR体系只能扩增相应的特异性异构体阳性模板，对其他特异性异构体的阳性模板均无扩增。

2.3 初诊APL患者中PML／RARα特异性异构体转录本含量

6例长型或变异型APL患者中bcr1／2异构体相对定量为7.71%～89.71%（中位数13.70%），P4R3异构体相对含量为0.71%～16.26%（中位数4.48%），P46R3相对含量为3.57%～14.09%（中位数6.33%）。4例短型患者中bcr3异构体相对含量为21.43%～197.04%（中位数100.69%），P2R3异构体相对含量为0.34%～9.07%（中位数2.45%）。见表4。

表4 10例APL患者各种PM L／RARα融合基因异构体检测结果

2.4 10例APL患者的随访监测

我们对10例APL患者的冻存样本进行了随访监测，截止到随访结束，仅有1例短型APL患者复发并死亡，其余9例患者均处于完全缓解期。死亡的1例患者在复发后4个月死于化疗后骨髓抑制伴败血症。

3 讨论

以往对APL等白血病的诊断及微小残留病灶的监测主要有细胞遗传学、荧光原位杂交技术（FISH）、Nouthern印迹、定性（半定量）PCR等技术。RQ-PCR技术具有快速、特异、敏感性高、可定量等优点，在临床上的应用日益广泛，然而，应用RQPCR方法来检测APL患者的PML／RARα融合基因6种异构体的研究却很少见。

由于目前国内外所应用的几种RQ-PCR引物缺乏异构体特异性，在同一反应体系中能同时扩增几种异构体，多为不同异构体的共同表达水平，无法提供每一异构体的各自转录水平，因此，检测结果提供的定量信息不准确，降低了对APL患者的预后评价和微小残留病灶监测的效用。为此，我们设计了PML／RARα融合基因不同异构体的特异性引物，成功建立了6种异构体的特异性定量检测方法。该方法的建立具有如下意义：①可以精确定量PML／RARα融合基因中各异构体的相对含量，便于异构体间含量的比较；②为探讨初诊APL患者PML／ RARα融合基因各异构体含量的临床意义提供了方法学保证；③可以动态监测异构体含量变化，判断其在预测患者复发中的作用。1例短型复发患者冻存标本的检测结果表明，在患者发生血液学复发前，其特异性短型和P2R3异构体含量均增高，证实了异构体监测在提示临床复发中的作用。虽然几个PML／RARα异构体已被发现多年，但其病理意义尚未完全明了。许多临床和实验研究均集中于3个常见的异构体（bcr1、bcr2和bcr3），并证实了其在APL中的致病机理以及在预后评价和微小残留病灶检测中的作用［5－6］。而对于P4R3、P46R3及P2R3等异构体的研究仍处于探索阶段。Ashur-Fabian等［7］发现长型APL患者经治疗后当荧光原位杂交检测转阴时，34例患者中有9例RTPCR仍可检出P46R3转录本，其中5例患者在随访过程中复发。最近又有报道显示转染了P4R3异构体的U937细胞株对于全反式维甲酸的敏感性低于P46R3和bcr1［8］。

我们所建立的异构体特异性RQ-PCR方法特异、敏感、可靠，可以对PML／RARα融合基因异构体进行定量检测。我们将进一步扩大病例进行检测，以进一步明确不同异构体的临床意义。

［1］Pandolfi PP，Alcalay M，FagioliM，etal.Genomic variability and alternative splicing generatemultiple PML／RARαtranscripts thatencode aberrant PML proteins and PML／RARαisoforms in acute promyelocytic leukaemia［J］.EMBO J，1992，11（4）：1397－1407.

［2］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］.3版.北京：科学出版社，2007：106－206.

［3］韩兰秀，林江，周剑波，等.51例APL患者PML／RARαmRNA转录本的检测及其意义［J］.重庆医学，2012，41（1）：1－3.

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types to detect relapse and optimize themanagementof acute promyelocytic leukemia［J］.Clin Lymphoma Myeloma Leuk，2010，10（Suppl3）：s139－143.

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［7］Ashur-Fabian O，Trakhtenbrot L，Dominissini D，et al.The presence of a single PML-RARA isoform lacking exon 5 in FISH-negative APL samples［J］.Leukemia，2008，22（1）：200－203.

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Quantification of six different PM L／RARαisoform s in patients w ith acute prom yelocytic leukem ia using quantitative real time PCR

HAN Lan-xiu1，2，LIN Jiang1，XU Xin2，QIAN Jun1，ZHOU Jian-bo2，WANG Ya-li1
（1.Department of Hematology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2.Department of Laboratory，the Affiliated Jiangyin Hospital，College of Medicine，Southeast University，Jiangyin Jiangsu 214400，China）

Objective：To establish a quantitative real time PCR（RQ-PCR）method for detecting the six different PML／RARαisoforms（bcr1／2，P4R3，P46R3，bcr3，P2R3）in acute promyelocytic leukemia（APL）patients，and evaluate the specificity of isoform-specific RQ-PCR.M ethods：Specific primers and probe of different isoforms were designed and isoform-specific RQ-PCR method for detecting each isoform was established.To evaluate the utility of this assay，bonemarrow samples from 10 APL patientswere detected.Results：In repeated tests，maximal sensitivity of 10 copies／μL for each isoform-specific RQ-PCR was obtained，however，the reproduciblemaximal sensitivities achieved 100 copies／μL.In the normal controls and the no-template control，any amplified fluorescent signalswere not detected.Each isoform-specific RQ-PCR could not amplify other isoforms.In five bcr1-positive cases and one bcr2-positive case，the expression level of bcr1／2，P4R3 and P46R3 isoformswas7.71%－89.71%（median 13.70%），0.71%－16.26%（median 4.48%），3.57%－14.09%（median 6.33%），respectively.In four bcr3-positive cases，the expression level of bcr3 and P2R3 isoforms was 21.43%－197.04%（median 100.69%）and 0.34%－9.07%（median 2.45%）.The expression level of bcr3 and P2R3 isoforms significantly de-creased in one case achieving complete remission after induction therapy compared to that in initial diagnosis，and significantly increased after relapse.Conclusion：Isoform-specific RQ-PCR method for six PML／RARαisoformswas a sensitive，reliable quantitative assay and could be used in the detection of the six different PM／RARαisoforms of APL and themeasurement ofminimal residual disease.

polymerase chain reaction；acute promyelocytic leukemia；PML／RARα；isoform

R783.5

A

1671－7783（2014）04－0324－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140135

江苏省医学重点人才资助项目（RC2007035）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2009206）；镇江市社会发展项目（SH2008041）

韩兰秀（1981—），女，主治医师，硕士，主要从事中心实验室的管理和实验操作；钱军（通讯作者）主任医师，硕士生导师，E-mail：qianjun0007＠sina.com

2014－05－22 ［编辑］陈海林