沙眼衣原体Tarp蛋白B细胞表位的预测与鉴定

冯 燕，朱珊丽，林晓云，薛向阳，李文姝，张丽芳

（温州医科大学微生物学与免疫学教研室，浙江温州325035）

沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis，Ct）型别众多，感染十分普遍，不仅是引起沙眼、致盲的主要原因，还可通过性接触途径引起男性尿道炎和女性宫颈炎[1]，因此也是性传播感染（sexuallytransmittedinfections，STIs）的主要病原之一。Ct感染可导致不良妊娠，如异位妊娠、流产等[2]，且经抗生素治疗后极易复发。Ct在细胞内完成独特的双相发育周期，即具有代谢惰性的感染性原体（elementarybody，EB）和代谢活跃的非感染性网状体（reticulatebody，RB）。发育周期完成后，EB从细胞中释放并感染邻近的细胞，从而形成循环增殖[3]。

原体和许多其他革兰阴性病原菌一样，通过III型分泌系统（typeIIIsecretionsystem，T3SS）分泌的多种毒力蛋白，即效应蛋白是其主要的致病因素[4]。近年来，学者发现衣原体T3SS的效应蛋白之一—Tarp蛋白，该蛋白在衣原体EB黏附宿主细胞时能诱导EB进入细胞[5]，故认为该蛋白可能作为衣原体的受体参与EB的黏附入侵。同时用该蛋白免疫小鼠，发现其能刺激小鼠产生较高滴度的特异性抗体和细胞免疫，而且能显著降低Ct引起小鼠生殖道感染的炎症程度[6]，故该蛋白可作为预防和治疗Ct感染的候选疫苗之一。但由于该蛋白分子质量较大（约100kDa），表达制备并保持蛋白的天然构象较为困难，故选择其表位作为研究对象。表位是抗原分子中可与T细胞和B细胞表面受体结合，诱导特异性细胞免疫和体液免疫，从而产生免疫保护作用的一段氨基酸序列。

本研究拟以生殖道感染最常见的E型Ct的Tarp蛋白为基础，利用生物信息学综合分析预测Tarp蛋白的B细胞表位，将预测获得的B细胞表位多肽经人工合成后免疫小鼠，进一步检测其刺激机体产生抗体的能力及抗体与天然Tarp蛋白的结合能力。具有免疫原性和抗原性的B细胞表位的筛选和鉴定，为进一步研究Tarp蛋白的生物学特性及表位疫苗研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂CtE血清Ct标准菌株购自美国典型物保藏中心（ATCC：VR-348B）；HeLa229细胞由本实验室保存；RPMI-1640培养液购自Hyclone公司；胎牛血清（FCS）购自杭州四季青公司；HRP-羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、FITC-羊抗鼠IgG抗体和FITC-羊抗兔IgG抗体均购自杭州联科生物科技有限公司；兔抗Ct血清多抗为本室制备[7]；碘化丙碇（PI）购自Solarbio公司；IP细胞裂解液和ProteinGAgarose购自碧云天生物技术研究所；表位多肽合成委托上海波泰生物科技有限公司。

1.2 E血清型CtTarp蛋白B细胞表位预测根据瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白质数据库得到E血清型CtTarp蛋白氨基酸序列。根据文献[8]提供的方法，即应用EXPASY服务器（http://www.expasy.ch/tools）上的GOR预测Tarp的二级结构；采用Hopp-Woods亲水性参数、Janin可及性参数、柔韧性参数预测（http://expasy.org/cgibin/protscale.p1）、Emini表面可能性，并按Jameson-Wolf方案预测蛋白的抗原性。将上述方法互相参照，综合分析比较，兼顾各项预测参数推断CtTarp蛋白B细胞识别的潜在位点。

1.3 BALB/c小鼠免疫采用氨基酸合成法合成筛选表位肽段，纯度为85%，用无菌0.9%氯化钠溶液稀释为4mg/mL。将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为8组，每组3只。首先将各表位肽与KLH经戊二醛偶联，取含100μg表位合成肽的偶联物与完全弗氏佐剂等体积充分乳化后，采用背部皮下多点注射途径免疫小鼠，同时设置PBS对照组。隔周进行，共免疫3次，2次的加强免疫多肽与不完全弗氏佐剂充分乳化。分别于第2、第4、第6周收集血清，分装后置-80℃备用。

1.4 免疫小鼠血清抗体IgG及其亚类的检测以20μg/mL的B细胞表位合成肽包被96孔酶标板，3%牛血清白蛋白（BSA）-PBST封闭，加入稀释的免疫小鼠血清样品，37℃反应1h，PBST洗涤后，分别加入1:2000稀释的HRP-羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a100μL，37℃反应1h，洗涤后经四甲基联苯胺（TMB）显色，加入2mol/LH2SO4终止反应。反应结果置BioElx800酶标仪于450nm波长处读取A值。每份血清标本均重复3孔检测。

1.5 阴道分泌物sIgA抗体的检测用无菌PBS缓冲液取小鼠阴道分泌物，每只小鼠采集200μL样品，置-80℃保存备用。ELISA法检测阴道分泌物sIgA抗体步骤同上，不同的是，二抗为HRP-羊抗鼠sIgA。

1.6 免疫沉淀实验及Westernblot法检测血清抗体与Tarp蛋白的结合能力E血清型Ct感染HeLa229细胞48h后，裂解液充分裂解HeLa229细胞，提取蛋白，与合成肽免疫血清4℃孵育过夜，再与ProteinGAgarose4℃孵育3h，2500r/min离心5min后，弃上清，获取沉淀物，用预冷PBS洗涤沉淀，2500r/min离心5min，获取洗涤后沉淀物。以SDS-PAGE分离沉淀后，转PVDF膜，封闭后与合成肽免疫血清孵育2h，洗涤后与HRP-羊抗鼠IgG作用1h，TBST漂洗3次，ECL显影，压片。同时用未感染Ct的HeLa229细胞作为阴性对照进行免疫沉淀实验和Westernblot法检测。

1.7 间接免疫荧光实验检测血清抗体与天然Tarp抗原的结合能力E血清型Ct感染HeLa229细胞48h后，2%多聚甲醛固定10min，用含0.3%TritonX-100的PBS透膜10min，洗涤后采用10%FCS-RPMI-1640室温封闭1h，加入稀释的合成肽免疫血清，同时设置阳性对照（兔抗Ct血清多抗）及阴性对照鼠抗PBS、鼠抗KLH血清抗体，与感染的细胞37℃孵育1h，PBS洗涤后，分别加入含FITC-羊抗鼠IgG、PI的二抗混合液和FITC标记的羊抗兔IgG、PI的二抗混合液，37℃孵育1h，封片后采用激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP2）观察。

1.8 统计学处理方法采用SPSS16.0统计软件。实验数据以表示，正态分布数据组间均数比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tarp蛋白B细胞表位的预测蛋白共有957个氨基酸，相对分子质量约为100kDa。通过生物信息学技术，预测Tarp蛋白的二级结构、亲水性（见图1A）、柔韧性（见图1B）、极性（见图1C）、表面可能性（见图1D）、抗原性（见图1E）等结果，兼顾各预测参数综合分析比较，推断CtTarp蛋白B细胞表位，共得到6个潜在的B细胞表位，其氨基酸序列分别为：（F1）aa80-95（TSSSSTQATATSNKTS）；（F2）aa107-123（TSESSETSSTSSSDHIP）；（F3）aa152-170（SNYDDAAADYEPIRTTENI）；（F4）aa171-186（YESIGGSRTSGPENTS）；（F5）aa239-253（VAAAALNSLRGSSY）和（F6）aa497-513（NTTNTTPTTQSTDASTD）。

图1 Tarp蛋白的各预测参数

2.2 血清特异性IgG抗体及其亚类产生情况合成肽包被聚乙烯微量反应板后采用ELISA法检测，结果显示，随着免疫次数的增加，F3和F4合成肽组血清特异性IgG抗体水平呈明显上升趋势。免疫后第4周，F3合成肽组血清（0.396±0.036）和F4合成肽组血清（0.267±0.04）特异性IgG抗体水平与其他组比较，差异有统计学意义（F=20.928，P＜0.05），同时，免疫后第6周，F3和F4合成肽组血清特异性IgG抗体水平与其他组比较，均值分别为0.572±0.040、0.619±0.053，差异有统计学意义（F=46.656，P＜0.05），见图2A；而F3组和F4组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。末次免疫后2周检测小鼠血清中IgG亚类水平，F3和F4合成肽组血清特异性IgG1抗体与其他组比较，均值分别为0.351±0.059、0.244±0.032，差异有统计学意义（F=24.427，P＜0.05），并且F3和F4两组间比较差异有统计学意义（F=9.103，P＜0.05），见图2B；同时检测IgG2a亚类的产生水平，各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对比IgG2a和IgG1抗体水平，F3和F4组多肽诱导的抗体以IgG1类型为主，即其诱导的免疫类型倾向于Th2型。

图2 不同免疫组小鼠血清特异性抗体IgG及其亚类IgG1和IgG2a的产生情况

2.3 阴道分泌物特异性sIgA抗体产生情况合成肽包被聚乙烯微量反应板后采用ELISA法检测，结果显示，随着免疫次数的增加，F4合成肽组小鼠阴道分泌物中特异性sIgA抗体水平呈明显上升趋势。免疫后第6周，F4组小鼠阴道分泌物中特异性sIgA抗体水平为0.503±0.048，与其余组比较，差异有统计学意义（F=39.213，P＜0.05），见图3。由于F4组多肽既能刺激机体产生血清抗体IgG和阴道分泌物抗体sIgA，故后续实验主要检测F4组多肽诱导的免疫血清。

2.4 Westernblot法检测血清抗体与Tarp蛋白的结合能力Ct感染HeLa229细胞48h后，使用细胞裂解液裂解细胞并提取蛋白，与F4多肽末次免疫后免疫小鼠血清抗体及ProteinGAgarose共沉淀，沉淀物经SDS-PAGE分离后，转PVDF膜进行Westrenblot法分析，结果（见图4）显示，F4多肽免疫组血清沉淀后除了分别在55kDa和22kDa处出现IgG的重链和轻链，且在相对分子质量（Mr）大小为105kDa处出现了一条明显的条带，与预期Tarp蛋白大小相符。而阴性对照（未感染Ct的HeLa229细胞）小鼠血清沉淀后只在相应位置出现IgG的重链和轻链。结果提示，F4组免疫血清抗体可与天然Tarp蛋白结合。

图3 不同免疫组小鼠阴道分泌物中特异性抗体sIgA的产生情况

图4 免疫沉淀实验及Westernblot法检测多肽免疫血清与Tarp蛋白的结合

2.5 间接免疫荧光实验检测血清抗体与Tarp蛋白的结合以抗F4多肽免疫血清为一抗，经间接免疫荧光实验检测其与天然Tarp蛋白的结合能力。结果（见图5）显示，细胞核经PI免疫荧光染色后呈红色荧光，F4血清抗体组细胞质中呈现绿色荧光，同时阳性对照组（Ct免疫兔血清）细胞质中也有绿色荧光呈现，而阴性对照组（PBS、KLH免疫组血清）均无绿色荧光显示。结果提示F4组免疫血清抗体可与天然Tarp蛋白高效结合。

3 讨论

图5 间接免疫荧光实验检测表位免疫血清与Tarp蛋白的结合（×400）

目前，Ct致病机制仍不清楚。虽有大量关于衣原体的疫苗研究，但至今尚无成熟疫苗问世。近年来研究发现，T3SS的效应蛋白之一Tarp蛋白，已成为Ct感染后疾病免疫预防研究的新靶点[9]。Tarp蛋白预存于T3SS的注射装置，该蛋白在衣原体EB黏附宿主细胞时能快速磷酸化，并诱导EB进入细胞，故认为该蛋白在衣原体感染宿主细胞的第一步─黏附过程中起到重要作用。同时Tarp蛋白有较强的免疫原性，有学者用该蛋白免疫小鼠，发现其能刺激小鼠产生较高滴度的特异性抗体和细胞免疫，而且能显著降低Ct引起小鼠生殖道感染的炎症程度[6]。故该蛋白可作为预防和治疗Ct感染的候选疫苗之一。

考虑到Tarp蛋白相对分子质量较大（约100kDa），表达制备并保持该蛋白的天然构象较为困难，故选择其表位作为研究对象。表位能诱导特异性免疫应答，同时可避免与特异性免疫无关成分导致的病理免疫应答，可诱导更强、更特异的免疫效应，是目前感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的研究热点[10-11]，因而CtTarp蛋白的表位研究引起了研究人员的重视。

Ct有19个血清型别，其中D、E、F、G和H等血清型主要引起泌尿生殖道感染，而其中E型则是国内外报道[12-13]中最为常见的型别。因此，本研究以E血清型CtTarp蛋白为基础，通过生物信息学技术分析，初步预测得到该蛋白的6个潜在的B细胞表位。Ct主要通过黏膜接触途径传播，血清中的特异性抗体IgG和阴道分泌物中抗体sIgA在保护生殖道Ct感染中起到非常重要的作用[14]。笔者将初步得到的6个潜在B细胞表位多肽经人工合成后免疫BALB/c小鼠，其中F3、F4多肽免疫组可在血清中检测到较高水平的特异性抗体IgG，并以IgG1亚类为主，表明免疫应答主要趋于Th2型，进一步说明这两段氨基酸为Tarp蛋白的B细胞免疫优势区。同时，F4多肽免疫组可在阴道分泌物中检测到显著高水平的特异性抗体sIgA，而F3多肽免疫组仅检测到较低水平特异性sIgA抗体，其原因可能与抗原的特性、机体对免疫原的敏感性[15]以及与免疫的途径[16-17]相关，因此笔者的后续实验主要检测F4组多肽诱导的免疫血清。

为进一步鉴定预测所得B细胞表位的抗原性，笔者通过免疫沉淀实验、Westernblot法和间接免疫荧光实验等方法检测了F4多肽免疫组血清与天然Tarp抗原的结合能力。免疫沉淀实验和Westernblot法检测结果显示，在相对分子质量约105kDa处检测到一条带，说明F4多肽免疫组血清可与感染了Ct的HeLa229细胞结合（表达天然Tarp蛋白），从而证实预测所得F4表位具有较强的抗原性。同时，Westernblot法检测结果中，在IgG轻链的上方可看到两条非特异性条带，说明该蛋白也可与F4多肽免疫血清结合，考虑为大分子量目的蛋白Tarp的降解产物。间接免疫荧光实验结果也显示F4多肽免疫组血清可与感染了Ct的HeLa229细胞结合（表达天然Tarp蛋白），从而进一步证实预测所得F4表位具有较强的抗原性。

本实验通过生物信息学分析初步预测并鉴定出Tarp蛋白的一个B细胞优势表位（aa171-186），其可诱导BALB/c小鼠产生血清中特异性以IgG1为主的体液免疫，且免疫血清可与天然Tarp蛋白结合，具有较强的免疫原性和抗原性。其免疫小鼠血清抗体的中和活性及对Ct动物感染模型的免疫保护作用研究正在进行中。