莪术醇软膏对糖尿病溃疡创面愈合的作用

周洁，朱雁林，董建勇，傅红兴，裘关关，方亮莲，林潍潍

（温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035）

糖尿病溃疡是常见的糖尿病慢性并发症之一，糖尿病患者中，溃疡的发病率约占4%～10%，是导致糖尿病患者致残和早亡的主要原因[1]，也是医疗费增加的主要因素[2-3]，患者皮肤损伤后创面愈合延迟或不愈合成为临床亟待解决的难点和热点[4]。研究表明，活血化瘀药在调节血管内皮细胞的内环境及其分泌功能，逆转内皮功能方面已取得较大进展[5]。

温莪术是临床上较为常用的活血化瘀药物，从其药用部位莪术油中提取的成分莪术醇具有抗肿瘤、抗炎、抗纤维化、抗氧化、促进血管生成及低细胞毒性特点[6-9]。本研究通过使用自制的莪术醇软膏，比较糖尿病大鼠与正常大鼠皮肤溃疡愈合情况及皮肤中胶原含量、内皮细胞黏附分子（CD31）及转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达差异，探讨其在糖尿病溃疡创面修复中的作用，为将来该莪术醇软膏的临床应用提供实验参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SD雄性大鼠48只，体质量180～220 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，饲养于温州医科大学实验动物中心，单笼饲养，恒温18～22℃，恒湿，自由饮水、摄食。本实验征得温州医科大学动物伦理委员会同意。

1.1.2 试剂和仪器：莪术醇由本实验室从莪术油中分离得到，经气相色谱鉴定纯度为99.3%；链脲佐菌素（Steptozocin，STZ）（美国Sigma公司）；罗氏血糖仪（德国罗氏公司）；电子分析天平（AL-104，瑞士Mettler Toledo公司）；HE染色试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；Masson三色染色试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；兔抗鼠CD31多克隆抗体（克隆号：M-20，稀释倍数：1:50，Santa Cruz公司，德国）；兔抗鼠TGF-β1一抗（美国Santa Cruz公司）；RM 2135超薄切片机（德国莱卡leica公司）；EC 350-1石蜡包埋机（德国莱卡leica公司）；光学显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 软膏的制备：将白凡士林、羊毛脂、液体石蜡按照10:1:1的配比加热充分搅拌混合均匀，配成空白软膏剂基质，再称取莪术醇混悬在少量超纯水中后加入软膏基质中充分搅拌，分别制成5%和10%的含药软膏[10-12]。

1.2.2 糖尿病溃疡造模：SD大鼠于实验前适应性喂养1周，随机抽取12只SD大鼠作为正常组，其余36只作为糖尿病造模组，过夜禁食13 h后，腹腔注射STZ（55 mg/kg），用pH 4.2的0.1 mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液配成10 mg/mL溶液，1周后尾静脉采血测血糖，当血糖值≥16.7 mmol/L且伴随出现“三多一少”症状者即为糖尿病造模成功[13]，再经过1周观测大鼠饮水饮食状况并记录血糖值后进行糖尿病溃疡模型制作。

溃疡制作方法[14]：10%水合氯醛0.3 mL/kg将大鼠麻醉，剔除背部毛发，再用脱毛膏去除残余毛发，用75%乙醇消毒背部皮肤，用外科手术剪剪去背部脊柱两侧对称部位直径1.8 cm的圆形全层缺失皮肤创面，深至筋膜，止血后以无菌纱布包扎备用。1.2.3 动物分组及给药：将造模成功的36只大鼠随机分成3组：空白基质组、5%莪术醇软膏组、10%莪术醇软膏组。单笼喂养每天固定时间给药1次，给药前用0.9%氯化钠溶液清洗创面，莪术醇软膏给药以覆盖创面为宜。

1.2.4 皮肤愈合指标的测定：给药后每天观察创伤表面及其周围的炎症反应、创伤的愈合情况，于创面给药治疗后第3、第7、第14和第21天分别对大鼠进行溃疡创面拍照，用Image-Pro Plus 5.0软件测定溃疡创面面积，溃疡愈合率计算公式：

创面愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%

1.2.5 皮肤标本采集：于给药后第3、第7、第14和第21天分别取创面标本，每个时间点每组处死3只大鼠，取创面组织标本，固定在4%多聚甲醛中，留作病理学观察及免疫组织化学指标检测。

1.2.6 大鼠皮肤溃疡面HE及Masson染色：取4%多聚甲醛里固定24 h后的标本，将其放入不同浓度乙醇水溶液中进行脱水，二甲苯透明后常规石蜡包埋纵向连续切片（5μm），行HE及Masson染色，显微镜下检查创面组织的病理形态，肉芽组织增生情况及上皮组织的形成。

1.2.7 免疫组织化学：用CD31及TGF-β1免疫组织化学法分别探查创面组织的血管化和细胞增殖阳性表达率。取石蜡包埋标本，进行超薄切片（5μm），用1:5多聚赖氨酸处理过的载玻片进行捞片，捞片后于烘箱烘片4 h，再经脱蜡至水、抗原修复和封闭后，切片上分别滴加一抗，37 ℃孵育1 h，随后二抗孵育，最后用DAB显色、苏木素轻度复染、脱水、透明和封片。

判断标准：显微镜下观察到胞质或胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，无棕黄色颗粒者为阴性结果。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 19.0统计软件。实验数据以±s表示，所有数据均进行正态性检验及方差齐性检验。多组样本均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后血糖及体质量变化 经STZ造模后，两组大鼠不同时期血糖和体质量的变化情况见表1-2。糖尿病造模组大鼠血糖明显高于正常组，体质量较正常组增长缓慢，造模较为成功。

表1 两组注射STZ后血糖浓度比较（±s，mmol/L）

与正常组比：aP＜0.05

组别 n 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天糖尿病造模组 3 6 2 0.8 2±2.0 5 a 2 1.8 0±1.8 4 a 2 2.5 9±2.2 8 a 2 2.4 7±2.2 4 a正常组 1 2 6.3 2±1.0 8 6.7 5±1.0 6 6.3 9±1.0 2 6.3 1±0.5 3

2.2 创面愈合情况及愈合率比较 在第3、第7、第14和第21天莪术醇软膏促进创面愈合明显快于空白基质组（见图1）。5%与10%两种不同浓度的莪术醇软膏相比较，随着肉芽组织的大量形成和逐渐成熟，伤口逐渐缩小并逐渐愈合，且10%莪术醇软膏组的愈合率高于5%莪术醇软膏组，但两者差异不明显（P＞0.05），见表3。说明莪术醇软膏刺激了上皮的再生化，促进了糖尿病溃疡的创面愈合。

表2 两组注射STZ后体质量变化比较（±s，g）

表2 两组注射STZ后体质量变化比较（±s，g）

与正常组比：aP＜0.05

组别 n 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天糖尿病造模组 3 6 2 0 9.9±1 1.6 2 2 3.9±1 4.9 a 2 5 7.6±4 8.5 a 2 7 1.6±5 1.9 a正常组 1 2 2 0 3.8±7.3 2 5 5.8±1 5.2 3 4 8.3±2 8.4 3 8 3.5±3 9.2

表3 实验性糖尿病溃疡大鼠溃疡愈合率（n=12，±s，%）

表3 实验性糖尿病溃疡大鼠溃疡愈合率（n=12，±s，%）

与空白基质组比：aP＜0.05

组别 第3天 第7天 第14天 第21天空白基质组 10.1±7.3 40.8±12.5 80.4±7.5 90.5±2.7 5%莪术醇软膏组 18.2±12.4a 61.7±5.2a 88.1±4.8a 95.6±1.5a 10%莪术醇软膏组 18.1±11.2a 65.3±8.2a 90.4±8.9a 98.7±4.5a

图1 各组创面愈合随造模后时间的变化情况

2.3 病理组织学观察

2.3.1 HE和Masson染色结果：创面组织的HE染色和Masson染色分别如图2和图3所示。

图2 创伤后第3、第7、第14和第21天各组的HE染色比较（×200）

图3 创伤后第3、第7、第14和第21天各组的Masson染色比较（×200）

5%莪术醇软膏组：第3天时炎症细胞出现浸润；第7天时肉芽组织生成；第14天时上皮组织开始形成，炎症细胞开始消退，成纤维细胞增加；第21天时创面基本上皮化，上皮层较空白基质组厚。随剂量加倍，10%莪术醇软膏组与5%莪术醇软膏组相比，第14天肉芽组织开始填充且在第21天时肉芽组织更厚，胶原纤维染色呈束状排列且更为紧密规整。空白基质组：第3天时可减少量炎症细胞浸润，胶原纤维排列疏松且不规则；第7天时可见炎症细胞比第3天时多，炎症细胞出现缓慢，且伤口有化脓现象；第14天时炎症细胞聚集，胶原纤维和成纤维细胞形成少，创面上皮化较给药组少。

2.3.2 CD31免疫组织化学：CD31的免疫组织化学将小血管的内皮细胞膜染成棕色（见图4）。创面组织的CD31的免疫组织化学结果如图4所示。在造模给药后第7天和第14天空白对照组和给药组CD31表达量均有不同程度的提高，且在给药10%莪术醇组CD31的表达量较多。在造模后第21天时，3组的CD31表达量都有所降低（见表4）。

图4 创伤后第3、第7、第14和第21天各组CD31表达的比较(×200)

表4 3组CD31阳性表达率比较（n=12，±s，%）

表4 3组CD31阳性表达率比较（n=12，±s，%）

与空白基质组比：aP＜0.05

组别 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天空白基质组 1 6.8 7±6.0 1 2 3.4 3±6.0 9 3 2.0 0±4.1 0 2 7.6 3±3.0 5 5%莪术醇软膏组 2 3.8 8±3.1 2 4 5.6 7±2.3 2 a 5 0.3 2±2.8 4 a 4 3.8 6±2.0 8 a 1 0%莪术醇软膏组 3 3.0 1±3.1 1 5 0.3 0±2.0 9 a 5 9.2 2±1.2 4 a 5 3.3 0±6.0 7 a

2.3.3 TGF-β1免疫组织化学：TGF-β1可以作用于成纤维细胞，产生细胞增生分化，合成胶原蛋白，调节创伤中各细胞间的相互作用。创面组织TGF-β1的免疫组织化学结果如图5所示。在造模后第7天，5%和10%莪术醇软膏组均有促进TGF-β1的表达，且给药组的表达量均高于空白基质组。在给药后第14天5%、10%莪术醇软膏组TGF-β1表达量达到顶峰。第7天和第14天时10%莪术醇软膏组的TGF-β1表达量高于5%莪术醇软膏组，而在第21天时10%莪术醇软膏组TGF-β1表达量较5%莪术醇软膏组略有下降（见表5）。

图5 创伤后第3、第7、第14和第21天后各组TGF-β1表达的比较（×200）

表5 3组TGF-β1阳性表达率比较（n=12，±s，%）

表5 3组TGF-β1阳性表达率比较（n=12，±s，%）

与空白基质组比：aP＜0.05

组别 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天空白基质组 2.3 3±0.5 8 4.3 3±1.5 3 5.6 7±0.5 8 5.3 3±0.2 3 5%莪术醇软膏组 3.6 7±1.5 3 8.0 0±2.6 5 a 1 6.6 7±1.1 5 a 1 5.0 0±1.0 4 a 1 0%莪术醇软膏组 3.2 5±0.9 6 1 1.3 3±1.5 3 a 1 9.5 0±3.1 1 a 1 3.0 0±1.8 3 a

3 讨论

据世界卫生组织最新公布的数据显示，我国已成为世界第一糖尿病大国，患病率为9.7%，已高于世界平均水平的6.4%[15]。作为糖尿病并发症之一的糖尿病难愈合创面的修复不仅困扰着临床医生，也是医学界面临的重大难题[4]。其中皮肤组织中血管退化，创面中血管生成迟滞，可能是糖尿病创面难愈的重要原因[16]。利用血管活性药物扩张血管，改善局部组织的微循环，增加氧供，在临床上已有广泛的应用[17]。临床病理发现，从糖尿病足溃疡中分离出的成纤维细胞其生理受损，分泌各类生长因子的功能降低，且增殖功能显著降低[18]。因此刺激或修复创面成纤维细胞的增殖、迁移功能，进一步诱导胶原生成的治疗也是促进糖尿病伤口愈合的研究方向。

伤口愈合是十分复杂的生物学过程，包括早期炎症细胞聚集，多种细胞的增生，毛细血管的形成等。充分的血供为组织修复提供充分的营养物质，保证了组织再生所需，有利于各种修复细胞增殖和发挥其功能活性，也是促进创面愈合创面微循环改善的重要标志[19]。而成纤维细胞在组织创伤修复过程中起保护创面、填补伤口等作用，因此，大量的成纤维细胞增殖及充分的血液循环是伤口愈合的关键。CD31可以探查创面组织血管化程度，创面的微血管组织中血管内皮细胞迅速增殖，进而形成新生微小血管以满足组织修复所需的营养与氧供，因此CD31阳性表达率是创面血管微循环改善的重要标志之一[20]。TGF-β1抗原表达多少与成纤维细胞增殖关系密切，是评价细胞增殖状态较好的指标[21]。大量的成纤维细胞在创基内增殖、迁移、分化，分泌大量的胶原基质，转化为肌成纤维细胞，充填组织缺损的同时与胶原基质协同作用收缩创面。

在本实验中，第3天时创面处于炎症水肿期，创面肉芽组织生长在起始阶段，3组间创面愈合率、胶原着色差异不明显，CD31和TGF-β1阳性表达率均不明显，5%和10%莪术醇软膏组与空白基质组相比差异不明显；第7天时，从表观上观察3组创面面积都开始减小，伤口边缘逐渐开始收缩，而5%和10%莪术醇软膏组的溃疡愈合率与空白基质组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；第14天时，3组处于溃疡修复过程中肉芽组织填充期间，伤口中心可见有新生上皮，可观察到给药组血管增生现象较第3天明显增强，10%莪术醇软膏组CD31和TGF-β1阳性表达率均高于5%莪术醇软膏组。此外成纤维细胞大量增殖，并开始分泌大量的胶原纤维。第21天时，10%莪术醇软膏组创面接近于愈合，胶原纤维粗大，大量细长梭状的纤维细胞呈束状排列，CD31的表达量高于5%莪术醇软膏组，但是TGF-β1表达量低于5%莪术醇软膏组，而空白基质组，纤维细胞少且排列不规则，有较多胶原纤维增生，但呈不规则分布，细胞间质疏松明显。

本实验通过观测糖尿病大鼠皮肤的愈合率，HE与Masson染色，及伤口愈合密切相关的病理组织学指标CD31、TGF-β1的阳性表达，发现莪术醇软膏促进糖尿病溃疡创面愈合可能是通过促进成纤维细胞增殖，以及胶原的合成，与新生的毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，从而促进表皮细胞的覆盖，达到伤口愈合的目的。且随给药浓度的加大，10%莪术醇软膏较5%莪术醇软膏能更快促进创面愈合，并在病理切片HE染色及免疫组织化学染色的结果中其胶原合成、CD31的阳性表达、TGF-β1蛋白阳性表达上更优，与表观愈合情况一致。当然，伤口愈合是一个极其复杂的过程，莪术醇软膏是否通过其他途径产生作用还有待于进一步研究。

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