实时心肌超声造影评价糖尿病早期心肌血流灌注改变的实验研究

郑磊，张明，梁天琳，茹翱，刘敏，赵应征，田新桥

（1.温州医科大学附属第二医院 超声影像科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学 药学院，浙江温州 325035）

糖尿病（diabetes milletus，DM）的发病率近年来在全球范围内迅速上升，严重威胁人类的生命健康。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是DM的一种严重并发症，也是造成患者死亡的重要原因[1-2]。微血管病变是DCM发生发展的重要因素之一，可导致心肌微循环异常。本研究应用实时心肌超声造影（real-time myocardial contrast echocardiography，RT-MCE）技术对DM早期大鼠心肌血流灌注进行定量评价，旨在探讨该技术检测DM早期大鼠心肌微循环异常的应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠，24只，鼠龄42～49 d，体质量180～220 g，平均（200±12）g，由温州医科大学实验动物中心购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.1.2 仪器：超声诊断系统（Acuson Sequoia 512C，西门子，德国）；血糖测定仪（罗氏活力型，德国）；光学显微镜（奥林巴斯DP72，日本）。

1.1.3 试剂：SonoVue超声造影剂（意大利Bracco公司生产，由上海博莱科信谊药业有限责任公司包装）；10%甲醛溶液（上海生工生物工程有限公司）；水合氯醛（加拿大Bio Basic有限公司生产，由上海生工生物工程有限公司分装）；链脲佐菌素粉剂（加拿大Bio Basic有限公司生产，由上海生工生物工程有限公司分装）；兔抗鼠CD31抗体/血小板内皮细胞黏附分子-1（加拿大Bio Basic有限公司生产，由上海生工生物工程有限公司分装）；即用型免疫组织化学试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；血糖试纸（德国罗氏活力型血糖仪专用试纸）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：24只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分成DM组与对照组，每组12只。

1.2.2 动物模型制备及判定标准：DM组大鼠腹腔注射1%链脲佐菌素溶液，注射剂量为70 mg/kg体质量（注射前用0.1 mol/L，pH 4.0～4.4的枸橼酸缓冲液配制），于注射后第3天和第7天取尾静脉血测定血糖浓度，血糖值大于16.7 mmol/L，且具有多食、多饮、多尿及体质量减轻症状者选为DM模型。对照组大鼠腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。通风恒温鼠笼饲养，消毒鼠饲料喂养，自由饮水，常规饲养8周。

1.2.3 造影剂的配制：将5 mL 0.9%氯化钠溶液加入SonoVue瓶中（瓶内含59 mg六氟化硫气体和25 mg冻干粉）即形成微泡混悬液，90%微泡直径小于6μm，平均直径约2.5μm，注射前振荡摇匀，并在实验过程中持续摇匀。

1.2.4 检查方法：实验大鼠10%水合氯醛臀肌注射麻醉，剂量为2 mL/kg。待充分麻醉后，心前区剃毛。采用Sequoia 512C彩色多普勒诊断系统，内置RT-MCE造影模式，探头频率设置为12～14 MHz（15L8-w线阵探头），将探头放置于大鼠心前区，探头与皮肤之间用耦合剂填充。按Cadence键进入造影模式，图像深度3～4 cm，按RES键局部放大感兴趣区域，将焦点聚集于远场，机械指数0.35，造影脉冲序列调制，调整增益至心肌组织内无明显声学信号，并在整个过程中保持恒定。造影剂输注方式为经尾静脉缓慢注射。在静息状态下行乳头肌水平左室短轴心肌造影，观察心腔及心肌内的造影剂充填，待心肌内造影剂充填充分后，用高能量脉冲（机械指数=1.6）破坏心肌内的造影剂，随后仪器自动转为低能量显像（机械指数=0.1），获得造影实时动态图像。所有实时动态图像存储在MO光盘，后导入Siemens Sygno US Workplace3.01分析软件脱机ACQ分析。

1.2.5 图像分析：在Siemens Sygno US Workplace3.01分析软件中，取第一帧左室短轴切面的前壁心肌组织勾画出感兴趣区域（避开心内膜、心外膜及乳头肌等干扰因素），软件自动对每一帧图像中感兴趣区域进行追踪，并允许操作者可以在任何一帧调整感兴趣区域的位置，使其始终位于相应的心肌组织内。分析软件对每一帧图像感兴趣区域的平均声学强度进行测量后，拟合成声学强度-时间曲线y=A×（1-e-βt），其中A为感兴趣区域的峰值声学强度，反映局部心肌的血容量，即微血管密度，β为造影剂灌注速度，反映心肌的血流速度，二者的乘积A×β代表局部心肌血流量，每只大鼠分析2～3次取平均值来减小误差。分析曲线的GOF系数小于0.9者均被剔除。

1.2.6 心肌组织CD31免疫组织化学染色：超声检查结束后，处死大鼠，取出心脏，取乳头肌水平左室心肌组织，用10%甲醛固定，石蜡包埋后切片。采用polymer法对心肌组织石蜡切片进行CD31免疫组织化学染色，光学显微镜下观察。每组取12张切片，每张切片随机选取20个高倍镜视野（×400），计算其中的微血管断面的数量，取平均值，作为心肌组织中的微血管密度（MVD）（个/高倍视野）。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量指标均采用±s表示，两组计量资料进行正态性检验与方差齐性检验，如资料符合正态分布且方差齐，均数比较采用成组样本t检验，如资料不符合正态分布或方差不齐，均数比较采用成组样本t’检验。DM组的A及MVD采用Peason相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 DM大鼠造模成功8周后，DM组死亡1只，另有1只因血糖浓度未达标而被剔除，对照组无死亡。因此，8周后进行超声检查时，两组数量分别为：DM组10只，对照组12只。

2.2 MCE各指标的比较 本实验中所有大鼠感兴趣区域均获得满意的MCE图像，并成功拟合出声学强度-时间曲线（见图1），拟合度为0.93～0.99。在静息状态下，两组大鼠前壁心肌组织MCE的各项指标中，DM组的A、A×β均较对照组明显减低（P＜0.01）；β较对照组减低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1 DM组及对照组MCE图像，可见DM组心肌血流灌注较对照组明显减低

表1 DM组和对照组MCE各参数及MVD值的比较（±s）

表1 DM组和对照组MCE各参数及MVD值的比较（±s）

注：dB：分贝；HP：高倍视野。与对照组比： aP＜0.01

组别 n A（dB） β（s-1） A×β（dB/s） MVD（/HP）DM组 10 18.56±2.02a 0.71±0.06 13.40±2.37a 13.30±1.89a对照组 12 24.13±2.52a 0.76±0.08 18.49±3.21a 26.08±2.51a

2.3 CD31免疫组织化学染色结果 CD31免疫组织化学染色结果显示毛细血管内皮细胞呈棕褐色（见图2），显微镜下MVD显示DM组MVD与对照组相比明显减低（P＜0.01）（见表1）。

图2 DM组及对照组心肌CD31免疫组织化学染色（×400）

2.4 相关性分析 DM组A与MVD呈线性正相关（r=0.903，P＜0.01）（见图3）。

3 讨论

RT-MCE技术是近年来发展起来的超声新技术，也是目前评价心肌血流灌注最为简便、准确且安全的方法，其原理是指将含有微气泡的造影剂通过外周静脉注入体内，由于目前应用的微泡大小与红细胞相当，血流动力学与红细胞相似，可自由通过心脏毛细血管而分布于心肌组织内，微泡在血液内产生大量的液-气界面，从而反射大量超声波信号，使心肌微循环的视频密度增加，利用超声技术观察心肌的对比增强，就可以在微血管水平评价组织血流灌注信息。应用高能量的超声脉冲破坏心肌内的超声造影剂，随后转为低能量模式，可以实时显示造影剂在心肌内随血流再灌注的过程，实现了心肌微循环的动态显示[3]。此外，与单光子发射计算机断层成像术（single-photon emission computed tomography，SPECT）和正电子发射断层成像术（positron emission tomography，PET）等技术相比，RTMCE还具有无创、重复性好及价格实惠等优点，因此，RT-MCE已逐步应用于定量评价心肌血流灌注的实验和临床研究之中[4-5]。然而，迄今应用RT-MCE技术评价DM早期心肌血流灌注的研究较少。

图3 DM组A与MVD散点图

本研究应用RT-MCE对DM早期大鼠心肌血流灌注进行定量分析，发现DM大鼠成模后8周时反映心肌血流灌注的指标A及A×β均较对照组明显减低，同期免疫组织化学染色显示DM早期大鼠心肌MVD与对照组相比明显减低。有学者[6]应用RT-MCE技术在开胸条件下检测DM早期大鼠心肌血流灌注情况，结果证实在静息状态下DM组心肌血容量和血流量较正常组明显减低。类似的研究结果在临床研究中也得到证实，李薇玢等[7]应用RT-MCE观察了早期2型DM患者心肌血流灌注情况，结果表明静息状态下2型DM患者心肌血流灌注较对照组明显减低。以上研究表明DM早期大鼠心肌微循环已经受到损伤。分析其原因，DM早期上述心肌血流灌注变化主要与高血糖引起的心肌微血管病变有关。已有的研究证实，微血管病变作为DCM心肌损害的特征性病变之一，主要表现为心肌微血管基底膜增厚、管腔横截面积减小、微血管密度减低等，这些改变可导致微循环障碍、心肌细胞缺血损伤和坏死。在本研究中，DM组β虽较对照组降低，但差异无统计学意义，可能与DM大鼠病程较短及样本量较少等有关。此外，通过对DM组的A与MVD进行相关性分析发现，两者呈明显的正相关关系，因此，造影指标A能较为准确反映MVD的变化，是评价心肌血流灌注的敏感指标。

综上所述，DM早期即可出现心肌血流灌注异常，RT-MCE技术可敏感地检测出这种微循环异常改变，具有重要的应用价值。然而，本研究尚存在一定的局限性，比如：本研究采用经胸RT-MCE无创评价心肌血流灌注虽具有一定优势，但因声像图受到胸廓和肺组织的干扰，部分室壁显示不理想因而无法评估；另外，本研究未行负荷心肌超声造影，未能评价DM大鼠早期血流灌注储备的变化，有待于今后进一步实验研究。

[1]Acar E, Ural D, Bildirici U, et al. Diabetic cardiomyopathy[J]. Anadolu Kardiyol Derg, 2011, 11(8): 732-773.

[2]Falcao-Pires I, Leite-Moreira AF. Diabetic cardiomyopathy:understanding the molecular and cellular basis to progress in diagnosis and treatment[J]. Heart Fail Rev, 2012, 17(3):325-344.

[3]Lepper W, Belcik T, Wei K, et al. Myocardial contrast echocardiography[J]. Circulation, 2004, 109(25): 3132-3135.

[4]Chen X, Cui K, Xiu J, et al. Evaluation and simplifi ed measurement of infarct size by myocardial contrast echocardiography in a rat model of myocardial infarction[J]. Int J Cardiovasc Imaging, 2009, 25(7): 713-716.

[5]Gurudevan SV, Nelson MD, Rader F, et al. Cocaine-induced vasoconstriction in the human coronary microcirculation:new evidence from myocardial contrast echocardiography[J]. Circulation, 2013, 128(6): 598-604.

[6]段云燕, 张军, 苏海砾, 等. 实时心肌超声造影评价早期胰岛素治疗对糖尿病大鼠心肌灌注的影响[J]. 中国超声医学杂志, 2011, 27(7): 581-584.

[7]李薇玢, 吕清, 谢明星, 等. 实时心肌超声造影评价2型糖尿病患者静息状态下心肌灌注特点的初步研究[J]. 中华超声影像学杂志, 2010, 19(8): 655-658.